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Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 7741 (2022) Citar este artículo

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La calidad inadecuada del agua potable es una de las principales causas de mortalidad prevenible, predominantemente en niños pequeños. La identificación de las fuentes de agua contaminada sigue siendo un desafío importante, especialmente donde los recursos son limitados. Los métodos actuales para medir Escherichia coli (E. coli), el indicador preferido por la OMS para medir la contaminación fecal del agua, involucran la incubación durante la noche y requieren capacitación especializada. En 2016, UNICEF lanzó un perfil de producto objetivo (TPP) para incentivar las innovaciones de productos para detectar niveles bajos de E. coli viable en muestras de agua en el campo en menos de 6 h. Impulsados por este desafío, desarrollamos un ensayo basado en fagos para detectar y semicuantificar E. coli. Formulamos un cóctel de fagos que contenía un total de 8 fagos seleccionados frente a una extensa biblioteca de cepas bacterianas y recombinados con el reportero sensible de luciferasa NanoLuc. El ensayo se optimizó para ser procesado en un chip de microfluidos diseñado internamente y se probó con muestras de aguas residuales de origen local y en fuentes de agua potable en Nairobi, Kenia. Con este ensayo, combinado con la plataforma de chip de microfluidos, proponemos una solución automatizada completa para detectar y semicuantificar E. coli a menos de 10 MPN/100 ml en 5,5 h por personal mínimamente capacitado.

La importancia del acceso sostenible al agua potable sigue siendo fundamental para reducir la pobreza y mejorar la salud y el bienestar de la población mundial. Aunque se ha avanzado hacia los Objetivos de Desarrollo Sostenible y su enfoque en aumentar el acceso al agua potable (ODS 6)1, la calidad de muchos suministros de agua sigue siendo incierta. Las enfermedades diarreicas, principalmente debidas a alimentos y agua contaminados, continúan siendo la segunda causa principal de muerte en el mundo en niños menores de cinco años, causando el 8% de todas las muertes en el mundo, con el 80% de las muertes ocurriendo en el sur de Asia y África subsahariana. África2. Inspeccionar la calidad del agua para detectar la presencia de patógenos que causan diarrea es vital para el bienestar de millones de personas.

Uno de los riesgos microbianos más significativos está asociado con la ingestión de agua contaminada con heces de humanos o animales3. Aunque la mayoría de los coliformes son inofensivos para los humanos, se utilizan en las pruebas para indicar la posible presencia de patógenos peligrosos. E. coli, en particular, tiene muchas características ideales de organismo indicador, ya que se deriva casi exclusivamente de heces humanas y animales e incluye algunas cepas patógenas (p. ej., O157:H7)4. Si bien el uso de indicadores fecales (coliformes, coliformes termotolerantes, E. coli) ha sido criticado debido a que su presencia solo implica que el riesgo de presencia de patógenos ha aumentado, el monitoreo de los cientos de patógenos transmitidos por el agua sigue siendo poco práctico y es extremadamente difícil hacerlo rápidamente. y a bajo costo4. Además, la información sobre la cantidad del indicador fecal es esencial ya que el riesgo de contraer una infección transmitida por el agua aumenta con el nivel de contaminación.

Los límites bacterianos aceptables han sido definidos por la OMS3, entre otros, y establece que toda el agua destinada a beber no debe tener E. coli o bacterias coliformes termotolerantes detectables en ninguna muestra de 100 ml, siendo E. coli ahora el indicador preferido. Los métodos más utilizados para la detección de coliformes en muestras de agua son la filtración por membrana, la fermentación en múltiples tubos mediante el método del Número Más Probable (MPN) y las pruebas de presencia/ausencia como la prueba del sulfuro de hidrógeno5. Si bien estos métodos pueden lograr una sensibilidad de 1 CFU/100 mL entre $0.5 y $7.5/prueba, a menudo son laboriosos, requieren capacitación de personal especializado, son difíciles de usar en el campo y requieren largos tiempos de incubación, generalmente durante la noche6. Ninguna prueba puede detectar rápidamente niveles bajos de E. coli viable en el agua en menos de 8 h7.

El equipo de innovación de productos de UNICEF lanzó el proyecto de detección rápida de E. coli para promover el desarrollo de nuevos productos para empoderar a las comunidades y socios gubernamentales con información esencial sobre la calidad del agua, permitiéndoles tratar el agua sucia e identificar áreas de mejora en la contaminación del agua. En consecuencia, UNICEF publicó un perfil de producto objetivo (TPP) para guiar a las industrias a desarrollar productos que determinen con precisión la contaminación fecal lo más rápido posible8.

Una nueva generación de ensayos utiliza bacteriófagos diseñados para detectar patógenos9, 10. Los fagos son virus que infectan y se multiplican dentro de las bacterias y se encuentran entre las entidades más comunes y diversas de la biosfera. Exhiben rangos de huéspedes específicos debido a interacciones complejas entre las proteínas de unión del fago y la superficie de la célula bacteriana11. Los fagos pueden modificarse genéticamente para llevar la información genética de una proteína indicadora que se expresa dentro de la bacteria durante la replicación del fago. El uso de fagos informadores como métodos de detección se ha demostrado previamente para detectar patógenos, incluidos Listeria12, Mycobacterium13, Salmonella14 y E. coli15. Los indicadores comúnmente utilizados incluyen, entre otros, fosfatasa alcalina16, proteína fluorescente verde (GFP)13, luciferasa bacteriana (sistemas lux)12, 17 y luciferasa NanoLuc®18,19,20. La luciferasa NanoLuc produce una señal de luminiscencia 100 veces más fuerte que otras luciferasas y es una proteína más pequeña (19 kDa) que se basa en el sustrato furimazine para producir una luminiscencia estable de tipo brillante21.

Aquí, usamos un cóctel de fagos indicadores de luciferasa NanoLuc para detectar específicamente la contaminación por E. coli en el agua. Hemos desarrollado un ensayo muy sensible y rápido que permite la detección de menos de 10 MPN de E. coli en 100 ml de agua en 5,5 h, lo que cumple con los requisitos TPP de UNICEF y, por lo tanto, permite realizar pruebas el mismo día. El cóctel de fagos tiene una amplia gama de huéspedes de E. coli que permite usar el ensayo en cualquier fuente de agua. Finalmente, el ensayo se realiza en un chip de microfluidos diseñado para integrarse con un prototipo de instrumento automatizado (una unidad de filtración, una unidad de manejo de líquidos y una unidad de detección)22 para uso en el campo. El costo total del dispositivo de microfluidos desechable es inferior a $1, y la instrumentación asociada cumple con los objetivos de costo establecidos por UNICEF TPP8, lo que convierte a esta plataforma en una alternativa adecuada a los kits de prueba de campo de E. coli actuales.

En el bacteriófago T4, Hoc (proteína de la cápside externa altamente antigénica) es una proteína de decoración de la cápside no esencial altamente expresada23, cuyo locus genético se ha utilizado con éxito para insertar proteínas en el genoma del fago24. Se han identificado proteínas similares en numerosos bacteriófagos y virus de doble cadena25,26,27,28. El análisis de la secuencia del genoma de nuestra biblioteca de fagos indicó la presencia de homólogos de Hoc en varios genomas, incluidos BW-1, HER252, Phi3, RB69, T7, TH07 y TH09, y se utilizó como sitio de inserción para un reportero NanoLuc fusionado con una celulosa. casete de expresión de motivo de unión (CBM). Como se muestra en la Fig. 1a, usamos el sistema CRISPR/Cas929,30,31 para diseñar todos los fagos, excepto T7 y TH09, para los cuales la recombinación homóloga más simple por sí sola fue suficiente para introducir ADN recombinante en el genoma del fago.

( a ) Esquema de la recombinación de fagos in vivo utilizando el sistema CRISPR-Cas9. Las células de la bacteria huésped se transforman con un plásmido donante que contiene el reportero NanoLuc-CBM flanqueado con regiones de homología izquierda y derecha con el fago (LHR y RHR), así como secuencias espaciadoras y crRNA seleccionadas. (b) El ensayo de placas de fagos muestra la presencia de placas en el césped bacteriano (foto superior) y la actividad de NanoLuc en las placas cuando se toman imágenes en una habitación oscura (foto inferior). Creado con BioRender.com.

El plásmido pCas9 expresa S. pyogenes Cas9 y tracrRNA de su promotor nativo, y una secuencia sintética corriente abajo del promotor Lac expresa constitutivamente la secuencia líder de crRNA y tres espaciadores flanqueados por repeticiones directas. El uso de múltiples espaciadores dirigidos hacia el locus hoc de un fago específico es doble; (1) varios gRNA dirigidos hacia un locus maximizan la frecuencia de escisión mediada por Cas9 del fago objetivo (2) la conservación de la secuencia dentro del locus hoc permite el uso de una secuencia sintética para diseñar múltiples fagos (con uno o dos espaciadores conservados).

El rendimiento de los ARNg se determinó midiendo la eficiencia de formación de placas (EOP), definida como la reducción logarítmica del título de fago en la cepa que expresa tanto Cas9 como ARNg en comparación con la cepa que expresa solo Cas9. Una eficiencia de formación de placas de 3 o superior indicó que el sistema CRISPR/Cas9 está funcionando como se desea, y los ARNg se seleccionaron para generar fagos recombinantes (Tabla S2). La recombinación homóloga exitosa fue confirmada por la actividad de NanoLuc en las placas formadas por los fagos recombinantes y la secuenciación (Fig. 1b). Sorprendentemente, uno de los fagos que expresan NanoLuc aislado durante la construcción del fago recombinante TH09 mostró una homología limitada con la secuencia original del fago TH09. Presumimos que su fago progenitor original estaba presente en una concentración muy baja, se recombinó en la región homóloga al plásmido donante TH09 y se seleccionó en función de la actividad de NanoLuc. La comparación de secuencias indicó que es un fago similar a T4. Este fago se denominó PJ133.

Debido a la naturaleza del promotor que impulsa la expresión del indicador, NanoLuc se expresa de forma constitutiva durante la amplificación de los fagos para producir reactivos de alto título y contribuye a la señal de fondo en ensayos posteriores. Por lo tanto, para mejorar la sensibilidad de nuestros ensayos posteriores, desarrollamos métodos para purificar el reportero.

El fago T7 se purificó aprovechando el módulo de unión a celulosa (CBM) fusionado con NanoLuc y usando lavados consecutivos con perlas a base de celulosa para unir y eliminar el indicador. Este método, que inicialmente estaba destinado a ser utilizado para todos los fagos recombinantes, no fue efectivo para otros fagos. Presumimos que algunos de los fagos se unen a las perlas, lo que da como resultado un título final bajo de la solución de fago purificada y que, en algunos casos, el reportero se une a las perlas con baja eficiencia, lo que da como resultado una señal de fondo alta, como se observó para el fago Phi6. . La filtración de flujo tangencial (TFF) usando cartuchos con membranas de corte de 500 kDa demostró ser un método confiable para eliminar el indicador de estas soluciones de fagos. La filtración se llevó a cabo durante 12 a 18 h hasta que los valores de luminiscencia se estancaron en 1000 URL o menos. La eficacia de la filtración mejoró constantemente mediante la adición de detergente (0,05 % de tween 80) a los medios durante el crecimiento de las células bacterianas y la propagación de los fagos32. Las concentraciones de hasta 0,3% de Tween 80 no afectaron el crecimiento bacteriano ni la infección por fagos (Fig. S1).

Se usó un proceso de selección descendente de fagos que siguió varios pasos como se describe en el esquema de la Fig. 2a para determinar la composición final del cóctel de fagos.

(a) Descripción del proceso de selección de fagos: 1. El ensayo de placa se realiza con la biblioteca de fagos completa (92 cepas) frente a un subconjunto de la biblioteca de E. coli (79 cepas). El archivo suplementario 2 contiene los datos detallados de formación de placas, 2. Los fagos se seleccionan a la baja (20 cepas) en función del rango de huéspedes aditivos calculado, 3. Los fagos se seleccionan más a la baja (10 cepas) en función de la eficiencia de recombinación con el reportero NanoLuc, 4. Rendimiento del ensayo de luminiscencia contra toda la biblioteca de E. coli (339 cepas), el éxito de la purificación y la estabilidad general para determinar la composición final del cóctel de fagos (8 cepas). (b) % de bacterias que producen placas tras la infección por fagos. (c) % de cepas de E. coli susceptibles a fagos recombinantes determinado por ensayo de luminiscencia. El rango de huéspedes es generalmente más amplio en el ensayo de luminiscencia en comparación con los resultados del ensayo de placa en cepas coincidentes (el recuadro muestra ejemplos; la Fig. S2 tiene la lista completa de fagos y el archivo complementario 2 muestra una comparación directa de las cepas coincidentes).

Para el primer paso, los rangos de huéspedes de 92 fagos de nuestra biblioteca se analizaron mediante un ensayo de placa en un subconjunto de cepas de E. coli que constaba de la primera mitad de la biblioteca ECOR (cepas n.° 1 a n.° 36)33 y 43 cepas ambientales. En este experimento, la formación de placas observada dentro del césped de la cepa huésped demostró la replicación y propagación del fago dentro del huésped y, por lo tanto, la susceptibilidad de la cepa bacteriana probada. Los fagos muestran una gran variabilidad en la sensibilidad del huésped, y algunos exhiben amplios rangos de huéspedes. Por ejemplo, más del 25 % de las cepas huésped demostraron susceptibilidad a los fagos TH09 y HER259, mientras que 14 fagos no formaron placa en ninguna de las 79 cepas de bacterias analizadas (Fig. 2b y Tablas S4 y S5 y Archivo complementario 2). Sobre la base de la amplitud de las coberturas de huéspedes individuales de fagos y la cobertura aditiva calculada de los fagos utilizados en combinación, se seleccionaron 20 fagos para modificarlos genéticamente.

El reportero enzimático NanoLuc se introdujo con éxito en los genomas de doce fagos, y sus rangos de huéspedes se evaluaron mediante el ensayo de luminiscencia en toda la biblioteca interna de cepas de E. coli (339 cepas descritas en los métodos y enumeradas en las tablas S2 y S3). Para el ensayo de luminiscencia, que es más propicio para la detección de alto rendimiento, se comparó una señal de pocillos que contenían tanto un huésped de E. coli como un fago recombinante con pocillos de control que contenían solo el fago recombinante (Fig. 2c). La susceptibilidad positiva del huésped se registró en todos los pocillos con luminiscencia por encima de los valores medios de fondo +3 desviaciones estándar (DE). Al comparar los resultados obtenidos para los ensayos de placa y luminiscencia en cepas coincidentes, notamos que el rango de hospedantes basado en el ensayo de luminiscencia es generalmente más amplio y muestra una sensibilidad adicional al rango de hospedantes (Archivo complementario 2). Por ejemplo, esta observación es evidente para los fagos HER252, BW-1 y PJ133, para los cuales el rango de huéspedes aumentó en un 49 %, 57 % y 75 %, respectivamente (la Fig. 2c, recuadro y la Fig. S2 muestra el resto de la fagos). Se probó una comparación del rango de hospedantes medido por ensayo de placas entre fagos modificados y de tipo salvaje para el fago T2 y no mostró diferencias en el rango de hospedadores, lo que sugiere que el cambio en el rango de hospedadores no se debe a la manipulación del genoma del fago. Además, la gama de huéspedes del fago PJ133 diseñado es más amplia cuando se evalúa mediante luminiscencia que mediante ensayo de placa (Archivo complementario 2).

La lista de fagos seleccionados se perfeccionó aún más en función de varios factores, como el tiempo de lisis, la eficiencia de producción del indicador y la estabilidad de la solución de fago purificada, con el objetivo de combinar fagos con títulos altos (> 109 PFU/mL) y un fondo de luminiscencia bajo que inducen la expresión de una señal de alta luminiscencia relativamente rápida (< 3 h) y que son estables a 4 °C. Por ejemplo, el fago reportero Phi7 y T7 tienen rangos de hospedadores basados en luminiscencia similares; sin embargo, T7 produjo una señal de luminiscencia positiva dos horas más rápido y se seleccionó sobre el fago Phi7. El título del fago T2 disminuyó un par de logs en el transcurso de unas pocas semanas durante el almacenamiento a 4 °C y no se consideró candidato para el cóctel. De manera similar, se encontró que el título del fago T6 disminuía durante los pasos de centrifugación y también se le quitó prioridad a favor de otros fagos con mejor estabilidad durante la purificación. Finalmente, el fago Phi6 se eliminó temprano en el proceso debido a la pobre eficiencia de purificación que resultó en altos niveles de fondo de luminiscencia.

Al final del proceso de ingeniería y selección de fagos, se desarrolló un cóctel de fagos que contenía ocho fagos: BW-1, HER252, Phi3, PJ133, RB69, T7, TH07 y TH09. El resultado de la prueba del rango de huéspedes basado en el ensayo de luminiscencia en toda nuestra biblioteca de cepas de E. coli para los fagos seleccionados se muestra en la Fig. 2c. La cobertura del rango de hospedantes varía del 27 % (T7) al 70 % (BW-1) y suma hasta el 90 % de la biblioteca si asumimos que no hay interferencias negativas de los diferentes fagos.

Se eligió la cepa de laboratorio ATCC 25922 para determinar la duración de la infección por fagos para lograr el límite bacteriano más bajo de detección, utilizando el cóctel de ocho fagos, ya que es una cepa de control de calidad incluida en la lista de la EPA de los EE. UU. para analizar el agua potable. La cepa es sensible a los fagos HER252, BW1 y PJ133, y el fago BW1 induce la señal de luminiscencia más fuerte (Fig. S3). Cuando los fagos están en cóctel, hemos observado que la señal está dominada por el fago que induce la señal más fuerte. Primero se incubó una dilución en serie de células bacterianas en fase estacionaria en una placa de 96 pocillos en medio de cultivo durante 2 h a 37 °C para permitir la recuperación y preparar las células para la expresión de proteínas antes de añadir el cóctel de fagos.

Para el paso de infección con fagos, las bacterias se incubaron con los fagos durante 1, 1,5, 2 o 2,5 h antes de concentrar el indicador NanoLuc expresado y medir la señal de luminiscencia resultante. La señal se normaliza a la luminiscencia de fondo generada solo por el cóctel de fagos y se compara para los diferentes tiempos de infección en varias concentraciones de células para determinar el límite de detección correspondiente para cada condición (Fig. 3). El valor MPN (Número más probable) representa el número de células que se agregaron por pocillo según lo determinado por un sistema Quanti-Tray/2000, por triplicado. A medida que aumenta el tiempo de contacto entre el fago y las células bacterianas, disminuye el límite de detección de la señal por encima del fondo. Por ejemplo, un período de incubación de 1, 1,5 y 2 h da como resultado una señal dos veces superior al fondo de 60, 20 y 8 células, respectivamente. El tiempo de incubación adicional después de 4 h de incubación total no da como resultado un aumento de la señal en el rango de números de células analizados.

Señal de luminiscencia media de 8 réplicas con rango intercuartílico normalizado al fondo de fago solo en función de MPN/pocillo para incubaciones de fago de 1, 1,5, 2 y 2,5 h utilizando ATCC 25922 y el cóctel de 8 fagos. Los valores de MPN se determinaron por Quanti-Tray/2000, por triplicado. La línea discontinua representa valores con un fondo de 2×.

Tenga en cuenta que, con la cepa ATCC 25922, no parece haber una ventaja ni una desventaja en la incubación de las bacterias con los fagos durante más de 2 h, ya que observamos que la señal se estabiliza después de 2 h. Por lo tanto, para experimentos posteriores con muestras de campo que contienen poblaciones bacterianas no caracterizadas y dentro del dispositivo de microfluidos22, utilizaremos un tiempo de incubación de fagos de 3 h para garantizar que todas las bacterias tengan tiempo de producir el reportero enzimático.

Reunimos una biblioteca de E. coli con una amplia diversidad geográfica (Tablas S2 y S3) y genética para seleccionar los fagos para el cóctel33. Sin embargo, queríamos evaluar al principio de la formación del cóctel si este proceso de selección de fagos estaba sesgado hacia poblaciones bacterianas específicas de nuestra colección. Por lo tanto, en el momento de esta evaluación de campo, nuestro cóctel se encontraba en una etapa temprana de desarrollo y contenía cuatro fagos, a saber, Phi3, Phi7, RB69 y T7. El rendimiento del cóctel preliminar de fagos se probó en combinación con un prototipo de chip microfluídico temprano diseñado para reemplazar los pasos manuales del ensayo, como se describe en nuestro trabajo anterior22 (Fig. 4a). El chip integra una primera membrana donde se capturan bacterias, se infectan con fagos y se expresa el reportero. Una segunda membrana en el dispositivo es donde se concentra y detecta el reportero expresado. El rendimiento del ensayo de microfluidos basado en fagos se probó en muestras de campo locales recolectadas del río Ngong que fluye a través de la ciudad de Nairobi, Kenia. Las muestras eran, en general, muy turbias y altamente contaminadas. Se prepararon diluciones de las muestras en agua destilada estéril antes del procesamiento para evaluar un rango de concentraciones bacterianas (Fig. 4b).

Validación del ensayo de cóctel de fagos preliminar en muestras de aguas residuales locales. (a) Primer prototipo del dispositivo microfluídico para la detección de E. coli en muestras de agua. Barra de escala: 10 mm (b) Señal de luminiscencia normalizada al fondo de fago solo de muestras de agua obtenidas usando un cóctel de 4 fagos (Phi3, Phi7, RB69 y T7) y procesadas a través del dispositivo de chip de microfluidos. Se recolectaron muestras de agua del río Ngong que fluye a través de la ciudad de Nairobi. Los valores de CFU se determinaron utilizando un kit de campo de filtración por membrana. La línea discontinua representa valores con un fondo de 2×.

Las adiciones de fluidos al chip de microfluidos se realizaron manualmente utilizando accesorios de caucho de silicona desechables que rodean los puertos de entrada/salida y proporcionan una interfaz para las puntas de pipeta que contienen los reactivos necesarios y los tubos conectados a la fuente de vacío. Se usó una fuente de vacío conectada a los puertos de salida para controlar el flujo fluídico dentro del dispositivo microfluídico. En este experimento, el volumen de agua procesada fue de 10 ml, que hemos demostrado en un estudio anterior para producir resultados equivalentes a la misma cantidad de bacterias en un volumen de muestra de 100 ml22. El ensayo se realizó durante un total de 5 h, dividido en un período de recuperación de bacterias de 2 h seguido de una infección de fagos de 3 h para garantizar que las células tuvieran tiempo suficiente para producir la enzima indicadora NanoLuc.

A partir de nuestros resultados, observamos una señal clara sobre el fondo para ambas muestras analizadas que contenían 9 CFU y para una de cada dos muestras que contenían 8 CFU (Fig. 4). Estos resultados demuestran que con un cóctel de 4 fagos ya podemos medir menos de 10 CFU de E. coli por 100 ml de agua. Además, tenga en cuenta que el kit de prueba de filtración utilizado aquí como método de referencia detecta la presencia de coliformes termotolerantes y no de E. coli específicamente, lo que representa solo alrededor del 80 % de los coliformes termotolerantes34, 35. Además, hay alrededor de 15 a 20 veces más no MI. coli en las muestras, según lo determinado por el recuento total en placa realizado por AgriQ Quest Laboratory en Nairobi, donde procesamos las muestras, y se estima que la abundancia relativa del género Escherichia/Shigella en la población bacteriana del lodo fecal es del 0,1 al 0,8 %. 36. Esto indica que el ensayo no detecta bacterias que no sean E.coli y que la gama de huéspedes de los fagos es específica de E.coli. Se observaron resultados similares para los experimentos realizados en las muestras del río en un formato de placa de 96 pocillos, lo que nos permitió analizar una mayor cantidad de muestras y réplicas (Fig. S4). Sobre la base de estos resultados preliminares, que confirmaron que nuestra biblioteca de E. coli era lo suficientemente diversa, proseguimos con el desarrollo del cóctel de fagos para diseñar un ensayo potencialmente más sólido con un mayor rango de huéspedes y un límite de detección más bajo. Tenga en cuenta que en el momento de la prueba, el fago Phi7 era parte del cóctel, pero luego se descubrió que no aumentaba el rendimiento del cóctel general y se eliminó a favor de los fagos con mejor rendimiento.

El cóctel de fagos completo, que contenía 8 fagos, se probó con muestras de aguas residuales recogidas en una planta de tratamiento de agua local (planta de tratamiento de agua del sur del condado de King en Renton, WA, EE. UU.). En cuanto a nuestra evaluación de campo del cóctel parcial, el ensayo se llevó a cabo utilizando un chip de microfluidos diseñado internamente, esta vez con una versión actualizada que se muestra en la Fig. 5a y se describe con más detalle en trabajos anteriores22. La nueva versión del dispositivo de microfluidos contiene todas las mismas unidades funcionales de la versión anterior; sin embargo, se hicieron pequeñas modificaciones para permitir un proceso de fabricación moldeado por inyección, lo que redujo considerablemente el costo total de la prueba. Se prepararon varias diluciones de la muestra de aguas residuales por duplicado (valores de MPN > 1000) o por triplicado (valores de MPN < 1000) para generar un rango de concentraciones de células para la prueba (Fig. 5b).

Validación del ensayo de cóctel de fagos final en muestras de aguas residuales locales. (a) Segundo prototipo del dispositivo microfluídico para la detección de E. coli en muestras de agua. Barra de escala: 10 mm (b) Señal de luminiscencia normalizada al fondo de fago solo de muestras de aguas residuales obtenidas usando el cóctel de 8 fagos y procesadas a través del dispositivo de chip microfluídico. Los valores de MPN se determinaron con un ensayo Quanti-Tray/2000. La línea punteada muestra una regresión lineal realizada en un subconjunto de datos, entre valores MPN de 1 y 100. La línea punteada representa valores con un fondo de 2×.

Los datos presentados aquí agregan los resultados obtenidos con muestras de aguas residuales recolectadas en dos días diferentes y para las cuales no se observaron diferencias. El valor x < 1 corresponde a un ensayo Quanti-Tray/2000 negativo que tiene un valor de Número más probable (MPN) asignado de menos de 1/100 ml según las instrucciones del fabricante. Para estas muestras, la señal de luminiscencia medida es comparable a la señal de fondo de los controles solo de fagos. Con un valor de MPN de 1 (intervalo de confianza (IC) del 95 % = 0–3,7 indicado por el fabricante), el ensayo de fagos detecta una señal más de 2 veces sobre el fondo en solo 1 de cada 3 muestras. A concentraciones celulares muy bajas, la población bacteriana sigue una distribución de Poisson37, lo que explica que algunas de las muestras diluidas pueden contener células mientras que otras no. Sin embargo, con un valor de MPN de 6, con un IC del 95 % = 2,3–12,1 que indica que la mayoría de las muestras contienen bacterias, se detecta una señal alrededor de 5 veces superior al fondo en las tres réplicas. Realizamos una regresión lineal solo en el rango inferior del número de células (< 100) para demostrar una curva de calibración simple para nuestro ensayo. Esto nos permite determinar rangos de número de bacterias en función de la respuesta de luminiscencia medida con el ensayo: < 1, entre 1 y 10, entre 10 y 100 y > 100.

Se necesitan métodos rápidos, de bajo costo y de campo para indicar la presencia de patógenos en las fuentes de agua en entornos de bajos recursos para identificar las fuentes contaminadas. Los métodos actualmente disponibles para las organizaciones gubernamentales y sin fines de lucro que a menudo realizan pruebas para cuantificar la contaminación por E. coli suelen implicar largos períodos de incubación y procesos complicados. Además, requieren capacitación especializada, o las muestras deben transportarse y procesarse en un laboratorio. Desafortunadamente, esto a menudo no es factible debido a la falta de infraestructuras cercanas y necesarias.

El diseño de una prueba rápida y de bajo costo para detectar niveles bajos de bacterias viables de E. coli en un gran volumen de agua (100 mL) ha demostrado ser un desafío para la comunidad científica. Esfuerzos anteriores han tenido éxito en el desarrollo de fagos informadores para esta aplicación18, 38, 39. Desafortunadamente, los métodos usan cepas de laboratorio y fagos con rangos de huéspedes y protocolos de ensayo muy limitados, lo que los hace inadecuados para aplicaciones de campo. Para abordar esta brecha, examinamos una biblioteca de 92 fagos, incluidos más de 50 fagos nuevos aislados para este trabajo, y validamos el rendimiento de un dispositivo de microfluidos que desarrollamos previamente en nuestro laboratorio en muestras de agua ambiental del mundo real de varios lugares. Nuestro método general combina:

Un cóctel de fagos con una amplia gama de huéspedes específicos de E. coli.

Un reportero enzimático, NanoLuciferase, que, combinado con el sustrato NanoGlo, produce una señal luminiscente muy brillante que permite un límite bajo de detección.

Un dispositivo de microfluidos desechable que combina un paso de concentración de bacterias, infección de fagos in situ y concentración de reportero expresado para aumentar la sensibilidad del ensayo antes de la detección.

Como primer paso hacia el desarrollo del ensayo, identificamos y diseñamos varios fagos que se seleccionaron en función de varias características (capacidad para recombinarse con el indicador NanoLuc, estabilidad durante y después de los procesos de purificación, pureza y título final del fago, tiempo para generar una señal, e intensidad de la señal de luminiscencia resultante de la infección) para combinarse en un cóctel de fagos. El ensamblaje de una biblioteca de cepas de E. coli para seleccionar fagos se basó en la diversidad genética y geográfica con un sesgo para las cepas aisladas en entornos de recursos limitados. El proceso de selección de fagos se basó en datos empíricos, ya que no encontramos formas de predecir la estabilidad de los fagos o el éxito de los procesos de purificación. Durante la determinación del rango de huéspedes, observamos que, para todos los fagos probados, el rango de huéspedes determinado por el ensayo de luminiscencia es más amplio que cuando se determina por el ensayo de placa. Presumimos que esta diferencia es el resultado de infecciones abortivas40, en las que una célula bacteriana infectada muere prematuramente y, por lo tanto, impide la producción y posterior propagación de fagos maduros. Si bien no se genera una infección sostenida y no se observan placas, la enzima informadora se produce a niveles lo suficientemente altos como para ser detectada. Alternativamente, las modificaciones al ensayo de placa (p. ej., una concentración más baja de recubrimiento de agar blando) podrían afectar la morfología de la placa y se explorarán más a fondo para investigar si se puede llegar a un acuerdo entre los resultados del ensayo de placa y luminiscencia.

La expresión de la enzima indicadora está controlada por un promotor constitutivo y, por lo tanto, se produce durante la propagación del fago. En consecuencia, dedicamos importantes esfuerzos de desarrollo en métodos de purificación para producir reactivos de fago con títulos altos y baja concentración de indicadores que no generan una señal de fondo sustancial. Solo el fago T7 se pudo purificar de manera eficiente utilizando rondas sucesivas de purificación con perlas de celulosa. Con este método, las perlas a base de celulosa se unen al motivo de unión a celulosa (CBM) fusionado con el indicador NanoLuc que luego se puede eliminar de la solución. Todos los demás fagos sufrirían caídas en los títulos, o la luminiscencia residual se estabilizaría en valores inaceptablemente altos debido a que una parte significativa de las proteínas NanoLuc no se unen a las perlas y permanecen enzimáticamente activas. Los métodos basados en la exclusión por tamaño, como la filtración de flujo tangencial, demostraron ser efectivos en estos casos y nos permitieron procesar grandes volúmenes.

En los ensayos que miden bacterias viables, suele haber una compensación entre el tiempo de detección y el límite de detección, ya que las bacterias que pasan por un período de recuperación y crecimiento generan una señal más alta. Se espera que las células bacterianas recolectadas de muestras de agua ambiental estén en un estado latente ya que el ambiente acuático tiene pocos nutrientes y una temperatura más baja que el tracto digestivo de los mamíferos. Cuando las células bacterianas en fase estacionaria se colocan en un medio rico en nutrientes a una temperatura óptima, las células entran primero en una fase de retraso, que es un período de tiempo inicial durante el cual las células se adaptan a su nuevo entorno y se preparan para un crecimiento exponencial41. Por lo tanto, para que las células expresen eficazmente la enzima informadora, queremos asegurarnos de que las células hayan entrado en la fase de crecimiento exponencial cuando las proteínas se expresan en niveles altos. Según estudios previos realizados dentro del dispositivo de microfluidos22, un período de 1 a 2 h de recuperación metabólica celular fue la cantidad mínima de tiempo necesaria para garantizar una infección eficaz por fagos. Dado que esperamos que las muestras de agua contengan varias cepas bacterianas con tiempos de recuperación potencialmente diferentes, elegimos un período de incubación de 2 horas antes de la infección por fagos. Luego, determinamos el tiempo para observar la máxima generación de señales después de la infección por fagos. Usando el cóctel de 8 fagos y una cepa de laboratorio, observamos la máxima generación de señales después de una infección de fagos de 2 h que se estanca en tiempos de infección más largos. Dado que no observamos un efecto negativo de tiempos de infección más largos y anticipamos que los fagos infectan una población bacteriana no caracterizada de muestras ambientales, elegimos un período de tiempo de infección de 3 h, lo que da como resultado un tiempo de incubación de ensayo total de 5 h.

Evaluamos el rendimiento del ensayo y validamos nuestro método de selección de fagos al principio del desarrollo probando el ensayo en muestras del mundo real en Nairobi, Kenia, un lugar donde se pretendía utilizar este producto. Esta evaluación es fundamental para evaluar correctamente el rendimiento del cóctel y garantizar la validez de nuestro método de selección de fagos. En el momento de esta evaluación, el cóctel de fagos contenía cuatro fagos (Phi3, Phi7, RB69 y T7). Con solo 4 fagos, el ensayo funcionó muy bien en estas muestras ambientales, detectando menos de 10 E. coli MPN/100 ml. Además, observamos poca señal sobre el fondo para las muestras que contenían 1 o menos UFC de coliformes termotolerantes, lo que indica que el ensayo es específico para E. coli. Juntos, los resultados demostraron que nuestra biblioteca interna de E. coli nos permite seleccionar fagos con rangos de huéspedes que no solo son específicos de nuestra biblioteca de E. coli y que infectarán una amplia gama de bacterias. Sobre la base de estos resultados, proseguimos con el desarrollo del cóctel de fagos y el ensayo. Tenga en cuenta que no se observaron efectos inhibitorios al agregar gradualmente nuevos fagos al cóctel; por lo tanto, es deseable un cóctel con un mayor número de fagos, ya que aumenta las posibilidades de encontrar cepas sensibles de E. coli en una muestra de agua.

Se recolectaron muestras de agua de una planta de tratamiento de agua local para validar aún más el rendimiento del ensayo basado en fagos y la composición del cóctel de fagos en muestras bacterianas complejas y el dispositivo de chip microfluídico. Estos resultados muestran que el método detecta células bacterianas de E. coli hasta 6 MPN de E. coli, en 5,5 h (tiempo total que incluye períodos de incubación, filtración y etapas de concentración del indicador) medido con el método de referencia Quanti-Tray/2000. Además, la señal varía linealmente con el recuento bacteriano, que se puede ajustar a una curva de calibración. Esto permite determinar niveles de contaminación, < 1 E. coli MPN/100 mL (sin a muy baja contaminación), 1–10 E. coli MPN/100 mL (baja contaminación), 10–100 E. coli MPN/100 mL ( contaminación alta) y > 100 E. coli MPN/100 mL (contaminación muy alta). Esta curva de calibración depende de la calidad de los reactivos de fago (título, pureza) y debería determinarse para cada lote de producción de cóctel de fago.

Para ser utilizado con el dispositivo de chip de microfluidos, nuestro laboratorio diseñó un instrumento que permite a un usuario con una capacitación mínima ejecutar el ensayo basado en fagos. El diseño del instrumento y el software están disponibles en nuestra publicación anterior de Alonzo et al.22. Junto con este instrumento, estamos proponiendo una solución completa para medir específicamente menos de 10 E. coli viables MPN/100 mL, en el campo, en 5.5 h mientras diferencia los niveles de contaminación bacteriana de E. coli relevantes por debajo de 1/100 mL, entre 1 y 10/100 mL, entre 10 y 100/100 mL, y más de 100/100 mL, a costos similares a los kits de prueba de campo existentes.

Para facilitar el acceso remoto, los prototipos pueden caber en un pequeño maletín Pelican del tamaño de un equipaje de mano, son livianos y pueden funcionar con baterías. Un mayor desarrollo del prototipo de instrumentación para agregar automatización y aumentar el rendimiento permitirá realizar pruebas en ubicaciones remotas por parte de usuarios mínimamente capacitados. Los esfuerzos de desarrollo adicionales sobre la estabilidad y el empaque de los reactivos, específicamente la liofilización de soluciones de fagos y sustratos, son de interés para mejorar la perspectiva de un sistema portátil. Será necesario probar el ensayo en aguas naturales en una variedad de ubicaciones para refinar la selección de fagos para producir una composición de cóctel robusta y lograr una alta sensibilidad y especificidad. Alternativamente, las modificaciones genéticas dirigidas de los componentes de la cola del fago involucrados en el evento de unión inicial han expandido con éxito el rango de huéspedes42. Estas estrategias también se pueden utilizar para diseñar bacteriófagos específicos destinados a detectar otros patógenos e indicadores en otras muestras líquidas, como orina o bebidas.

Nuestra colección de bacterias consta de 339 cepas de E. coli, incluidas 72 cepas que representan la biblioteca ECOR33 comprada en la Universidad Estatal de Michigan, 116 cepas compradas en el centro de referencia de E. coli en la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Estatal de Penn y 151 cepas aisladas de muestras de agua recolectados en países de ingresos bajos y medianos (LMIC) de varias fuentes de agua (ríos, pozos y aguas estancadas). Las muestras de agua recolectadas de LMIC se filtraron a través de membranas de 0,45 µm (Millipore HAWP04700) que luego se colocaron en placas de medios selectivos MLGA (Sigma # 39734) y se incubaron a 30 °C durante 4 h seguidas de 18 h a 37 °C. Se recogieron y sembraron hasta 10 colonias de E. coli por fuente de agua para aislarlas de posibles contaminantes. Las cepas seleccionadas se cultivaron en TSB (caldo de soja trípica) y se almacenaron a -80 °C.

Nuestra colección de fagos consta de 92 fagos líticos, incluidos 39 fagos comprados en Université Laval, QC y 53 colifagos (etiquetados como TH-#) aislados de muestras de aguas residuales recolectadas en una planta de tratamiento de agua local (Condado de King, Departamento de Recursos Naturales y Parques, Departamento de Aguas Residuales). división de tratamiento) como se describió anteriormente43. Brevemente, las aguas residuales sin tratar (25 ml) se mezclaron con 2 × LB (caldo Luria) (25 ml) y un cultivo nocturno de células huésped de E. coli (500 µl) en un matraz de 150 ml. Después de la incubación durante la noche (37 °C, 250 rpm), la centrifugación (3000 × g, 10 min) y la filtración (0,22 µm) del cultivo, el sobrenadante produjo un lisado de fago que posteriormente se purificó en placas tres veces en la cepa huésped original. para producir un stock de fago homogéneo. Los genomas de los fagos aislados se secuenciaron completamente en un Illumina Miseq como se describe en otra parte43. Los fagos se depositaron en la colección Nugen de la Universidad de Cornell.

El rango de huéspedes de cada fago de nuestra colección se determinó mediante un ensayo de placa de doble superposición (agar LB y superposición de agar LB blando al 0,8 %)44 en un conjunto limitado de bacterias que consta de 36 cepas de la biblioteca ECOR (ECOR n.º 1 a n.º 36). ) y 43 bacterias aisladas de muestras de agua ambiental.

Las enzimas de restricción, la ligasa de ADN T4, la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi y las células de E. coli competentes NEB 5-alfa se solicitaron a New England Biolabs, Inc. Los oligonucleótidos utilizados en este estudio fueron sintetizados por IDT. El plásmido que expresa S. pyogenes Cas9 (pCas9) fue gentilmente obsequiado por Sam Nugen, Universidad de Cornell. GenScript sintetizó el plásmido que expresaba el gen de la luciferasa NanoLuc® optimizado por codón de E. coli vinculado a un CBM2a45 C-terminal a través de un conector flexible (pUC57-NanoLuc) y los plásmidos que expresaban 3 × gRNA, dirigidos a regiones específicas en el fago. Las secuencias de fagos se descargaron del NCBI o se secuenciaron internamente en un Illumina MiSeq como se describe en otro lugar43. Las secuencias se ensamblaron utilizando el software Geneious (versión 11.1.5, Biomatters Ltd., Auckland, Nueva Zelanda)46 y se compararon con otros genomas utilizando NCBI BLAST47, PSI-BLAST48 y Clustal Omega49.

La ingeniería de fagos se realizó in vivo, utilizando el sistema CRISPR-Cas9 como se describió anteriormente en una cepa competente en recombinación homóloga50. El plásmido donante específico de fago se generó mediante clonación en dos pasos en NEB 5-alfa. En primer lugar, se amplificaron de 600 a 1500 pb de las regiones de homología izquierda y derecha (LHR y RHR) utilizando ADN de fago como plantilla y se clonaron aguas arriba y aguas abajo del casete NanoLuc-CBM utilizando el protocolo de mezcla de ensamblaje NEBuilder HiFi. A continuación, se clonaron la secuencia líder de ARNcr funcional y el casete de ARNg 3 × en su respectivo plásmido específico de fago para construir el plásmido donante final. Todos los pares de cebadores y secuencias de gRNA utilizados se enumeran en las tablas S1 y S2. Se electroporaron secuencialmente 100 ng de pCas9 y plásmido donante específico de fago en DY331 usando condiciones estándar. La cepa DY331 transformada con éxito se indujo transitoriamente para genes rojos lambda favorables a la recombinación como se describe en otra parte51. A continuación, las cepas se infectaron con el fago apropiado (títulos de 104 a 109) para la recombinación in vivo y se vertieron en agar blando.

Nano-Glo® (Promega, Madison, WI), preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se pulverizó uniformemente sobre las placas y se tomaron imágenes para detectar placas de fagos recombinantes brillantes. Los fagos recombinantes se recogieron en tampón PBS (1 ml), y se sembraron diluciones en serie de diez veces en su huésped respectivo tres veces para purificar los fagos recombinantes. Todos los fagos recombinantes fueron confirmados por secuenciación. Para T7, el fago informador se construyó ensamblando fragmentos de PCR superpuestos del genoma del fago T7 y el casete de expresión informador. Cada fragmento adyacente tiene una homología ≥ 30 pb. Los cebadores utilizados para amplificar el genoma T7 y el sitio de inserción del casete informador son los descritos anteriormente52. El fago TH07 recombinante se seleccionó sembrando el fago de tipo salvaje en una cepa que albergaba un sustrato de intercambio alélico y examinando las placas brillantes como se describió anteriormente.

Los fagos recombinantes se propagaron en cultivo líquido según los métodos anteriores53. Los cultivos de la noche a la mañana de células huésped (NEB 5-alfa) se diluyeron (1:100) en medio TSB suplementado con Tween 80 (0,05%). Las células huésped se incubaron (37 °C, 250 rpm, OD600 = 0,15), se inocularon con una solución madre de fago (MOI = 0,1) y se incubaron más (37 °C, 250 rpm, 3–5 h) para producir un título alto. lisado de fago. El lisado se centrifugó (3750 × g, 10 min) para formar sedimentos celulares y el sobrenadante se filtró (0,22 µm, EMD Millipore, Burlington, MA, EE. UU.) antes de almacenarlo a 4 °C. Las soluciones de fago se purificaron para eliminar el NanoLuc expresado durante la propagación. Se añadieron perlas de celulosa (Avicel, PH-101, ~ 50 µm, Millipore Sigma, Darmstadt, Alemania) (5 g por 100 ml, 30 min, 250 rpm, 37 °C) a los lisados de fago para unir el indicador y se eliminaron mediante filtración. (0,22 µm) antes de la filtración de flujo tangencial (TFF). Se agregaron lisados de fago parcialmente purificados (50 ml) a tampón SM (Tris-HCl 50 mM, sulfato de magnesio 8 mM, cloruro de sodio 100 mM, gelatina al 0,01 %, pH 7,5) con Tween 80 al 0,05 % (450 ml) y se colocaron en el Sistema Minimate TFF (Pall Biotech, Nueva York, NY, EE. UU.) con una membrana de corte de 500 kDa. Se realizó una diafiltración continua hasta que se estancaron los valores de luminiscencia del retenido. A continuación, la solución de fago purificada se concentró hasta su volumen original, se recuperó de la membrana y se almacenó a 4 °C. El procedimiento de purificación para el fago T7 consistió en lavados de celulosa consecutivos (5 g por 100 ml, filtración estéril, repetir de 5 a 7 veces) hasta que los valores de luminiscencia se estabilizaron. Las soluciones de stock de fago con un título alto (> 109 UFP/mL) se trataron con azida de sodio (0,05 %) para crear una solución de stock de fago de almacenamiento. Finalmente, se preparó una solución de cóctel de fagos mezclando soluciones de stock de ocho fagos en TSB (cada una a una concentración final de 1:80 del stock) y se almacenó a 4 °C hasta que esté listo para usar. Los títulos de fagos fueron estables durante al menos 6 meses.

La gama de huéspedes de los fagos recombinantes se evaluó en la biblioteca completa de E. coli (339 cepas) en un ensayo de placa de múltiples pocillos. Se añadió cultivo de E. coli durante la noche (7,5 µl) a TSB (117,5 µl) en una placa estándar de 96 pocillos y se incubó (37 °C, 1,5 h, 100 rpm). Se añadió una solución de fago en tampón TSB (25 µL) a título alto (> 108 PFU/mL) a los pocillos apropiados (composición final del pocillo: TSB con MgCl2 10 mM, CaCl2 2 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5). La placa se incubó durante 3 h más, después de lo cual se transfirieron 100 µL del cultivo a una placa blanca de 96 pocillos, se mezcló 1:1 con sustrato NanoGlo y se incubó a temperatura ambiente durante 3 min antes de leer con un lector de placas ( BioTek Synergy H1, altura de lectura de 1 mm, integración de 1 s).

Un cultivo de la noche a la mañana de ATCC 25922 se diluyó en serie en PBS para producir soluciones que contenían entre 1 y 1000 bacterias E. coli/ml, según lo medido por la técnica del número más probable (MPN) utilizando un sistema Quanti-Tray/2000, por triplicado. Cada dilución (40 µl) se añadió en ocho pocillos repetidos de una placa de filtro de PVDF de 96 pocillos (Corning) y se filtró para recoger las bacterias. A continuación, se añadió TSB (90 µl) a cada pocillo y la placa se incubó (37 °C, 2 h). La solución de cóctel de fagos (10 µl) se añadió a los pocillos apropiados y la placa se incubó durante 1, 1,5, 2 o 2,5 h. Después de la incubación, la solución se filtró y se recogió el indicador NanoLuc. La solución de filtrado se añadió a una placa blanca con filtro de celulosa de 384 pocillos (Pall, Acroprep) y se filtró de nuevo para recoger y concentrar el indicador en la membrana de nitrocelulosa. Se añadió sustrato Nano-Glo (10 µl) a cada pocillo y se midió la luminiscencia como se describió anteriormente.

Se diseñó internamente un dispositivo microfluídico de detección de bacterias y se subcontrató para su fabricación (HC 1101-001, Hochuen Medical Technology, Shenzhen, China). Se puede encontrar una descripción completa del dispositivo de microfluidos en un estudio separado22. Brevemente, el dispositivo consta de dos características funcionales interconectadas: (1) un área de filtración de baja unión a proteínas diseñada para aislar y cultivar bacterias de muestras de agua ambiental seguido de una infección de fagos de cóctel in situ y (2) un área de activación y recolección a base de celulosa para la enzima indicadora de luminiscencia inducida por fagos.

Se recolectaron muestras de agua (≥ 100 ml) en Nairobi, Kenia, del río Ngong a lo largo del área de Mukuru Kayaba y se transportaron a un laboratorio cercano. Se recolectaron muestras de aguas residuales (≥ 100 ml) de una instalación local. La turbidez se midió con el medidor de turbidez HTTURB® (Wagtech Projects Ltd., Thatcham, Reino Unido) y las muestras se diluyeron a 1 NTU para su procesamiento con el dispositivo de microfluidos. Las muestras se diluyeron en serie en agua destilada para generar un rango de concentraciones de células para la prueba. La dilución deseada (100 ml) se agregó a los medios TSB (10 ml) en una jeringa conectada al chip de microfluidos mediante un conjunto de filtración personalizado. Durante el proceso de filtración, se aplicó vacío al puerto de salida, lo que provocó que las partículas de más de 0,45 µm, incluidas las células de E. coli, fueran capturadas en una membrana de PVDF. Para aumentar la actividad metabólica de las células aisladas, la cámara del canal serpenteante por encima de la membrana de PVDF se rellenó con medio TSB (250 µL) que contenía Tween 20 (0,1%). Luego, el chip se incubó en una incubadora de laboratorio (37 °C, 2 h). A continuación, se reemplazó el medio con una solución de cóctel de fagos a > 107 (250 µl). El chip se incubó adicionalmente (37 °C, 3 h) para permitir la infección por fagos. Luego se aplicó vacío para transferir la enzima NanoLuc-CBM producida desde la membrana de PVDF a la membrana de captura de nitrocelulosa (NT). Finalmente, se agregó sustrato Nano-Glo (75 µL) a la cámara debajo de la membrana NT. La luminiscencia se leyó de inmediato, utilizando un conjunto de detección personalizado con un tubo fotomultiplicador (ET Enterprises, Ltd., Uxbridge, Reino Unido)22. El kit de filtración por membrana Aquasafe® WSL50 Pro (Wagtech Projects Ltd., Thatcham, Reino Unido) se usó para cuantificar las CFU dentro de las muestras del río, y el sistema Quanti-Tray/2000 (IDEXX, Westbrook, ME) se usó para determinar el MPN en aguas residuales muestras

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Descargar referencias

Los autores agradecen a Bill and Melinda Gates Foundation Trust por su patrocinio a través de Intellectual Venture's Global Good Fund I, LLC (www.globalgood.com), la planta de tratamiento de agua King County South en Renton, WA, EE. UU., por proporcionar muestras de aguas residuales, y AgriQ Quest Laboratory en Nairobi por proporcionar espacio de laboratorio.

Luis F. Alonzo, Spencer Garing, Ethan Spencer y Anne-Laure M. Le Ny

Dirección actual: Global Health Labs, 14360 Eastgate Way, Bellevue, WA, 98007, EE. UU.

Paras Jain y David Bell

Dirección actual: Centro de Terapia Celular e Ingeniería Celular, Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering, Nueva York, NY, 10065, EE. UU.

sam nugen

Dirección actual: Consultor independiente, Issaquah, WA, 98027, EE. UU.

Laboratorio de empresas intelectuales, 14360 SE Eastgate Way, Bellevue, WA, 98007, EE. UU.

Luis F. Alonzo, Paras Jain, Troy Hinkley, Nick Clute-Reinig, Spencer Garing, Ethan Spencer, Van TT Dinh, David Bell, Kevin P. Nichols y Anne-Laure M. Le Ny

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

LFA y A.-LLN escribieron el manuscrito con el apoyo de PJ, NC-R., SG y TH. PJ y TH hicieron los fagos recombinantes. NC-R. realizó los experimentos de rango de huéspedes de fagos. SG y TH mantuvieron y purificaron los fagos con la ayuda de ES. ES adquirió muestras de aguas residuales. LFA realizó los experimentos en los chips de microfluidos. VD, DB y SN contribuyeron a la planificación del proyecto. A.-LLN supervisó el proyecto con KN. Todos los autores brindaron comentarios críticos, ayudaron a dar forma a la investigación y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Anne-Laure M. Le Ny.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Alonzo, LF, Jain, P., Hinkley, T. et al. Detección rápida, sensible y de bajo costo de la bacteria Escherichia coli en muestras de agua contaminada mediante un ensayo basado en fagos. Informe científico 12, 7741 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11468-2

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Recibido: 13 diciembre 2021

Aceptado: 18 abril 2022

Publicado: 11 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11468-2

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