Secuenciación de metagenomas y 768 genomas microbianos de filtraciones frías en el Mar de China Meridional

Scientific Data volumen 9, Número de artículo: 480 (2022) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Las comunidades microbianas de filtración fría son ecosistemas fascinantes en la Tierra que proporcionan modelos únicos para comprender las estrategias de vida en entornos distintos de aguas profundas. En este estudio, se generaron 23 metagenomas a partir de muestras recolectadas en el campo de filtración fría del Sitio-F en el Mar de China Meridional, incluida el agua de mar muy cerca de las comunidades de invertebrados, los fluidos de filtración fría, los fluidos debajo de las comunidades de invertebrados y la columna de sedimentos alrededor. la ventilación de filtración. Mediante herramientas de agrupamiento, recuperamos un total de 768 genomas ensamblados en metagenoma (MAG) que se estimó que estaban > 60 % completos. De los MAG, se estimó que 61 estaban completos en >90 %, mientras que otros 105 estaban completos en >80 %. El análisis filogenómico reveló 597 MAG bacterianos y 171 arqueales, de los cuales casi todos estaban lejanamente relacionados con aislados cultivados conocidos. En los 768 MAG, las abundantes bacterias en el nivel de filo incluían Proteobacteria, Desulfobacterota, Bacteroidota, Patescibacteria y Chloroflexota, mientras que las abundantes Archaea incluían Asgardarchaeota, Thermoplasmatota y Thermoproteota. Estos resultados proporcionan un conjunto de datos disponible para un mayor interrogatorio de la ecología microbiana de aguas profundas.

Mediciones)

genomas ensamblados en metagenoma

Tipos de tecnología

Secuenciación de metagenomas y agrupamiento de genomas.

Muestra Característica - Organismo

microorganismo

Muestra Característica - Ambiente

bioma marino de filtración fría

Muestra Característica - Ubicación

mar del Sur de China

Las filtraciones frías son manifestaciones del lecho marino de la migración de fluidos ricos en metano desde el subsuelo sedimentario y sustentan comunidades únicas a través de interacciones quimiosintéticas alimentadas1. Los microorganismos que habitan en las filtraciones frías transforman la energía química del metano en productos que sustentan ricas comunidades bentónicas alrededor de las fugas de gas2. El uso de métodos de secuenciación de próxima generación ha mejorado enormemente la comprensión de los microbiomas filtrados y hará avanzar la ecología microbiana desde el patrón de distribución de diversidad microbiana hasta la estrategia de supervivencia adaptativa en entornos de aguas profundas.

La filtración fría en el Sitio F (también conocida como Formosa Ridge) es una de las filtraciones frías activas en la vertiente nororiental del Mar de China Meridional (SCS)3, donde el hidrato de gas natural quedó expuesto en el lecho marino y fue cubierto por quimiosintéticos. comunidades compuestas principalmente por mejillones de aguas profundas y cangrejos galatheidos4. Los caracteres geoquímicos han sido ilustrados por la detección in situ utilizando el sistema de sonda de inserción Raman (RiP) desarrollado y sensores integrados5,6,7. Las variaciones horizontales y verticales en las concentraciones de metano mostraron tendencias contrastantes en los campos desde el centro de las comunidades florecientes hasta el margen de los sedimentos6. No se detectaron picos Raman de CH4 o H2S en los fluidos de filtración fría, mientras que se identificó CH4 disuelto en los fluidos bajo las exuberantes comunidades quimiosintéticas, y los perfiles de agua intersticial de sedimentos recolectados cerca de la filtración fría se caracterizaron por la pérdida de SO42− y un aumento de CH4 , H2S y HS− picos5,7. Dado que las comunidades microbianas en las filtraciones frías de aguas profundas a menudo están formadas por componentes geoquímicos en soluciones de filtración, recolectamos muestras del campo de filtraciones frías del Sitio-F en 2017, incluida el agua de mar cerca de las comunidades de invertebrados, los fluidos de filtraciones frías, el fluidos debajo de las comunidades de invertebrados y la columna de sedimentos alrededor del respiradero de filtración (Fig. 1 y Tabla 1). Los metagenomas se secuenciaron con la plataforma Illumina HiSeq X Ten, y cada metagenoma produjo aproximadamente de 52,7 Gbps a 80,6 Gbps de bases limpias (Tabla 2). Además, obtuvimos 768 genomas ensamblados en metagenoma (MAG) de bacterias y arqueas ambientales que se estima que están > 60 % completos y < 20 % contaminados (Tabla complementaria 1). De los MAG, se estimó que 61 estaban completos en >90 %, mientras que otros 105 estaban completos en >80 %. Hubo 59 MAG de alta calidad (completitud > 90% y contaminación < 5%), que representan el 7,68% del total. Las arqueas metanotróficas anaeróbicas (ANME), las bacterias metanotróficas aeróbicas Methylococcales, las Desulfobacterales reductoras de sulfato, así como las Campylobacterales y Thiotrichales oxidantes de sulfuro (Tabla complementaria 2), coinciden bien con los metabolismos microbianos más favorables en las filtraciones de metano en términos de suministro de sustrato. Mientras tanto, el análisis filogenómico sugiere que este conjunto de borradores de genomas incluye genomas muy buscados que carecen de representantes cultivados, como archaea Bathyarchaeota (30), Aenigmarchaeota (29), Heimdallarchaeota (20) y Pacearchaeota (10), y bacterias Patescibacteria ( 44), WOR-3 (23), Zixibacteria (13), Marinisomatota (12) y Eisenbacteria (6) et al. (Figura 2). Además, también hay algunos filos nuevos potenciales que incluyen NPL-UPA2 (7), UBP15 (4), FCPU426 (2) y SM23–31 (2) et al. Todos los genomas ensamblados de metagenoma preliminares no redundantes descritos aquí se depositaron en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Se espera que estos datos proporcionen un recurso para el análisis posterior que actúe como referencia para la genómica comparativa a gran escala dentro de grupos filogenéticos vitales a nivel mundial, además de permitir la exploración de nuevos metabolismos microbianos.

Proceso de recogida de muestras y análisis de datos. (a) Ubicación y área de muestreo en el campo de filtración fría en el norte del Mar de China Meridional. ( b ) Resumen esquemático del muestreo y análisis metagenómico realizado en este estudio. Cada rectángulo simboliza procesos que contienen descripciones (en negrita), métodos o herramientas utilizadas en el análisis correspondiente.

Diversidad filogenética de 768 genomas ensamblados en metagenoma (MAG) de la filtración fría en el Mar de China Meridional (Tabla complementaria 2) y genomas de referencia de Bacteria y Archaea disponibles en RefSeq (Tabla complementaria 3). La barra de escala corresponde a 3,00 sustituciones por posición de aminoácido. Se proporciona el número de borradores de genomas en cada nodo. Las ramas con puntos rojos no tienen representantes cultos.

El buque de investigación KEXUE recuperó muestras de un campo de filtración fría en el norte de SCS durante el crucero en septiembre de 2017 (Fig. 1 a y Tabla 1). El agua que se encuentra muy cerca de las comunidades de invertebrados se recolectó mediante un cilindro de muestreo de agua in situ equipado en un vehículo operado a distancia (ROV) FAXIAN durante las inmersiones 164 y 165 (ID de muestra: SW_1 y SW_2, respectivamente). El fluido de filtración fría se recolectó en las columnas de gas durante la inmersión 166 (ID de muestra: SW_3), y el fluido debajo de las comunidades de invertebrados se recolectó durante la inmersión 167 (ID de muestra: SW_4). Aproximadamente 15 L de agua de cada muestra se filtraron a través de una membrana de policarbonato de 0,22 μm (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). Las membranas se almacenaron a -80 °C y se utilizaron para la extracción de ADN. El ROV recolectó un núcleo de sedimentos en el área de sedimentos reductores cerca de las comunidades de invertebrados durante la inmersión 157. Se descartó una capa externa delgada (< 1 cm) del núcleo de empuje para evitar la contaminación. El núcleo de sedimento reducido negro, de 20 cm de longitud, se cortó en capas cada dos centímetros con un equipo de núcleo de empuje (ID de muestra: RS_1 ~ RS_10). Se recolectó otro núcleo de sedimento en el mismo sitio mediante un sistema de extracción de núcleo largo controlable y monitoreable de peso ligero de aguas profundas8, y las capas de muestra de 0~300 cm debajo del fondo marino (cmbsf) se recolectaron del núcleo de sedimento y se cortaron en 35- cm submuestras (ID de muestra: RS_11 ~ RS_19). Todas las submuestras se almacenaron a -80 °C hasta la extracción de ADN. Los datos ambientales (CH4, H2S y SO42−) se detectaron in situ mediante un espectrómetro Raman láser de aguas profundas montado con el ROV en el informe anterior5,9.

En la Fig. 1b se muestra una descripción general esquemática del flujo de trabajo en este estudio. El ADN genómico de 2,5 g de cada submuestra de sedimento se extrajo con el kit de aislamiento de ADN PowerSoil (QIAGEN). El ADN genómico de los filtros de 0,22 μm se extrajo con el kit de aislamiento de ADN PowerWater (QIAGEN). El ADN se examinó mediante electroforesis en gel y la concentración de ADN se midió con el kit de ensayo Qubit® dsDNA en el fluorómetro Qubit® 2.0 (Life Technologies, CA, EE. UU.). El valor de OD está entre 1,8 y 2,0, los contenidos de ADN superiores a 0,4 μg se utilizan para construir la biblioteca (Tabla 2).

La secuenciación metagenómica se realizó en Novogene (Tianjin, China) utilizando los protocolos Illumina 2 × 150 PE en una plataforma Illumina HiSeq X Ten. Se realizó un preprocesamiento de los datos sin procesar obtenidos de la plataforma de secuenciación mediante Readfq v8 (https://github.com/cjfields/readfq) para adquirir los datos limpios para su posterior análisis. Los datos limpios de las 23 muestras están disponibles en NCBI Genbank (SRA) con los números de acceso SRR13892585~SRR13892607 (Tabla 2), y dentro del número de acceso de BioProject PRJNA707313.

El montaje inicial de novo se realizó utilizando MEGAHIT v1.1.3 con parámetros por defecto10. Primero se excluyeron los ensamblajes genómicos cortos (< 1000 pb) que podrían haber sesgado el análisis posterior. Luego, los genomas se agruparon en función de su frecuencia de tetranucleótidos, cobertura diferencial y contenido de GC, así como el uso de codones, utilizando diferentes herramientas de agrupamiento, incluidas MetaBAT 2, MaxBin 2.0 y CONCOCT implementadas por MetaWRAP v1.2.1 pipeline (parámetros predeterminados) (Tabla complementaria 1)11,12,13. Los resultados del agrupamiento se refinaron con el paquete MetaWRAP (parámetros: -c 60 -x 20)14 y todos los conjuntos de contenedores producidos se agregaron y desreplicaron con una identidad de nucleótidos promedio (ANI) del 95 % con dRep v2.3.2 (parámetros: -comp 60 -con 20 -sa 0.9)15. La clasificación taxonómica de cada contenedor se determinó mediante CheckM v1.0.3 y GTDB-Tk con parámetros predeterminados (Tabla complementaria 2)16,17. Luego, CheckM v1.0.3 (parámetros: lineage_wf)17 realizó la evaluación de la calidad de los contenedores (integridad > 60 % y contaminación < 20 %) de diferentes contenedores. A continuación, los contenedores seleccionados para cada muestra se volvieron a ensamblar utilizando metaSPAdes implementados a través de la canalización MetaWRAP14,18. Las regiones de codificación de los MAG finales se predijeron con Prodigal v2.6.3 (modo de metagenoma -p meta)19. Todos los genes pronosticados se buscaron en la base de datos nr y en la base de datos de procariotas KEGG utilizando Diamond Blastp (parámetros: -e 1e-5–id 40)20,21. Los datos de todos los MAG están disponibles en NCBI Assembly con los números de acceso JAGLBO000000000~ JAGMFB000000000 (Tabla complementaria 1).

Los 768 borradores de genomas y las 208 secuencias de genomas de referencia a las que se accedió desde NCBI GenBank (Tabla complementaria 3) se combinaron para encontrar ortólogos para el análisis filogenético mediante Orthofinder (parámetros predeterminados)22. Cada ortólogo se alineó usando MUSCLE v.3.8.31 (parámetros:–maxiters 16)23, se recortó usando trimAL v.1.2rev59 (parámetros: -automatizado1)24 y se evaluó manualmente. El árbol genético de cada ortólogo se construyó utilizando FastTree v2.1.9 (parámetros: -gamma -lg;)25. El árbol de especies final se infirió en base a 40 080 árboles de genes usando STAG v1.0.0 (https://github.com/davidemms/STAG) y se visualizó y anotó usando FigTree v1.4.3 (http://tree.bio.ed. ac.uk/software/figtree/) (Fig. 2).

Este proyecto ha sido depositado en DDBJ/ENA/GenBank bajo el número de acceso de BioProject. PRJNA707313, con Sequence Read Archive depositado bajo las accesiones SRR13892585~SRR1389260726,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44 ,45,46,47,48. Otros datos están disponibles a través de figshare49, incluidos los archivos fasta que contienen los contigs de todos los 768 MAG, el formato newick del árbol filogenético.

La contaminación potencial de las muestras se limitó siguiendo las pautas para los análisis de las comunidades de microbiota50,51. Brevemente, las muestras fueron pretratadas en una estación estéril en el laboratorio del buque de investigación KEXUE. Las extracciones de ADN se llevaron a cabo en un espacio de laboratorio dedicado bajo una campana de flujo laminar utilizando técnicas asépticas (como esterilización de superficies, DNA-OFF, uso de material de plástico estéril y uso de puntas de pipeta con barrera para aerosoles). El procesamiento de la muestra se completó en 2 días, utilizando el mismo lote del kit de aislamiento de ADN PowerSoil para todas las muestras de sedimentos y el kit de aislamiento de ADN PowerWater para todas las muestras de filtros de agua. Las lecturas de Illumina filtradas y recortadas se evaluaron en cuanto a sus cualidades de secuenciación utilizando fastp v0.20.1 (https://github.com/OpenGene/fastp) con parámetros predeterminados52. En todas las muestras, se calculó la puntuación Q para las lecturas de cada muestra y mostró que más del 90 % de las lecturas obtuvieron una puntuación Q30 (Tabla 2), lo que indica que la mayoría de las lecturas se construyeron con tasas de error bajas. Los datos del metagenoma se ensamblaron y refinaron en MAG utilizando los pasos de control de calidad automatizados y los procedimientos de ensamblaje descritos en el manuscrito. Para asegurar la calidad del montaje de los contigs, se seleccionaron varios kmers (21,29,39,59,79,99,119,141) en los procedimientos de montaje de MEGAHIT. En cuanto al agrupamiento, se seleccionaron estándares más estrictos y la secuencia posterior al agrupamiento se volvió a ensamblar para garantizar el mejor resultado.

Los métodos anteriores indican los programas utilizados para el análisis dentro de las secciones relevantes. El código utilizado para analizar paquetes de datos individuales se deposita en https://github.com/zhcosa/MAGs-from-cold-seep.

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Reconocemos el apoyo del buque de investigación KEXUE de la principal infraestructura científica y tecnológica nacional de la Academia de Ciencias de China (CAS) y Canter for Ocean Mega-Science, CAS. Estamos especialmente agradecidos con los pilotos y la tripulación de FAXIAN ROV. También agradecemos a todos los miembros del laboratorio por su asesoramiento técnico y debates útiles. Este trabajo fue financiado por el Marine S&T Fund of Shandong Province for Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao) (2022QNLM030004-3), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (42030407 y 42076091) y el Proyecto de Usuario Principal de RV KEXUE (KEXUE2021GH01 y KEXUE2019GZ06).

Estos autores contribuyeron por igual: Huan Zhang, Minxiao Wang.

Centro de Investigación de Aguas Profundas y Laboratorio Clave CAS de Ecología Marina y Ciencias Ambientales, Instituto de Oceanología, Academia de Ciencias de China, Qingdao, 266071, China

Huan Zhang, Minxiao Wang, Hao Wang, Hao Chen, Lei Cao, Zhaoshan Zhong, Chao Lian, Li Zhou y Chaolun Li

Centro de megaciencias oceánicas, Academia de Ciencias de China, Qingdao, 266071, China

Huan Zhang, Minxiao Wang, Hao Wang, Hao Chen, Lei Cao, Zhaoshan Zhong, Chao Lian, Li Zhou y Chaolun Li

Universidad de la Academia China de Ciencias, Beijing, 100049, China

chaolun li

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MW, HZ y CL diseñó el estudio. MW, HZ, HC, LC, CL y ZZ recogieron las muestras. MW, HZ, HC, HW y LZ realizaron el análisis. HZ y MW escribieron el documento y prepararon la figura y las tablas. Todos los coautores comentaron el manuscrito final.

Correspondencia a Chaolun Li.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Zhang, H., Wang, M., Wang, H. et al. Secuenciación de metagenomas y 768 genomas microbianos de filtración fría en el Mar de China Meridional. Datos científicos 9, 480 (2022). https://doi.org/10.1038/s41597-022-01586-x

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Recibido: 14 Abril 2022

Aceptado: 21 de julio de 2022

Publicado: 06 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-022-01586-x

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