Las membranas intracitoplasmáticas se desarrollan en Geobacter sulfurreducens en condiciones termodinámicamente limitantes

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 18 (2023) Citar este artículo

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Geobacter sulfurreducens es una bacteria electroactiva capaz de reducir óxidos metálicos en el medio ambiente y electrodos en sistemas de ingeniería1,2. Geobacter sp. son los organismos clave en las biopelículas electrogénicas, ya que su respiración consume productos de fermentación producidos por otros organismos y reduce un aceptor terminal de electrones, por ejemplo, óxido de hierro o un electrodo. Para respirar aceptores de electrones extracelulares con una amplia gama de potenciales redox, G. sulfurreducens tiene una red compleja de proteínas respiratorias, muchas de las cuales están unidas a la membrana3,4,5. Hemos identificado estructuras de membrana intracitoplasmática (ICM) en G. sulfurreducens. Este ICM es una invaginación de la membrana interna que se ha plegado y organizado por un mecanismo desconocido, a menudo pero no siempre ubicado cerca de la punta de una célula. Usando microscopía confocal, podemos identificar que al menos la mitad de las células contienen un ICM cuando crecen en superficies de ánodo de bajo potencial, mientras que las células que crecen en superficies de ánodo de potencial más alto o que usan fumarato como aceptor de electrones tenían una frecuencia de ICM significativamente más baja. Los modelos 3D desarrollados a partir de tomogramas crioelectrónicos muestran que el ICM es una extensión continua de la membrana interna en contacto con el espacio citoplásmico y periplásmico. La abundancia diferencial de ICM en células cultivadas bajo diferentes condiciones termodinámicas respalda la hipótesis de que es una adaptación a la disponibilidad limitada de energía, ya que un aumento en las proteínas respiratorias unidas a la membrana podría aumentar el flujo de electrones. Por lo tanto, el ICM proporciona una superficie de membrana interna adicional para aumentar la abundancia de estas proteínas. G. sulfurreducens es la primera Thermodesulfobacterium o reductor de óxido de metal que produce ICM.

Si bien diferenciamos clásicamente a los procariotas de los eucariotas por una diferencia en la compartimentación de los orgánulos del citoplasma, la realidad es más complicada. Los procariotas con una diversa variedad de metabolismos y nichos ecológicos expresan varios organelos intracelulares bien definidos6,7,8. La mayoría de los orgánulos que se han caracterizado en los procariotas pertenecen a una de dos categorías. Los primeros son compartimentos aislados donde se mantienen condiciones especializadas para realizar procesos químicos que no son posibles en el espacio citoplasmático, por ejemplo, el anammoxosoma9, el carboxisoma10 y el acidocalcisoma11. La segunda categoría de orgánulos procarióticos consta de estructuras de membrana densamente empaquetadas que facilitan un mayor rendimiento de los procesos metabólicos dependientes de la membrana al aumentar el área de superficie disponible en una célula, por ejemplo, el tilacoides, el clorosoma12 y las estructuras membranosas en los oxidantes de metano, nitrito y amoníaco13. 14,15,16. Usamos el término general 'membrana intracitoplasmática' (ICM) para describir todas estas estructuras lipídicas en procariotas, ya que incluye orgánulos con estructuras membranosas con funciones desconocidas. Para organismos que operan con márgenes termodinámicos estrechos o que realizan reacciones químicas lentas, la tasa de actividad enzimática, por ejemplo, la producción de ATP, debe ser proporcional al área de superficie de la membrana disponible para esas enzimas. En algunas bacterias oxidantes de metano, por ejemplo, se han encontrado dos enzimas metabólicas esenciales, la metano monooxigenasa y la metanol deshidrogenasa, en el ICM, lo que hipotéticamente proporciona un mayor rendimiento para una reacción potencialmente limitante de la velocidad14,17, y lo mismo se ha observado con el amoníaco. monooxigenasa en bacterias oxidantes de amoníaco15. Curiosamente, la relación entre las proteínas de membrana y los ICM va en ambos sentidos, ya que la modificación de una bacteria para sobreexpresar una enzima unida a la membrana puede estimular estructuras similares a ICM en una bacteria que normalmente carece de orgánulos18,19.

Geobacter sulfurreducens es una termodesulfobacteria gramnegativa (anteriormente clasificada como δ-proteobacteria) que reduce el hierro y otros metales en ambientes anaeróbicos1. Como organismo adaptado para respirar óxidos de metales insolubles en la naturaleza, G. sulfurreducens también es capaz de respirar aceptores de electrones sólidos hechos por el hombre2. En un sistema diseñado, podemos aprovechar esta transferencia de electrones extracelulares (EET) para producir una corriente eléctrica medible. La secuenciación de amplicón de biopelículas electroactivas generalmente encuentra que la especie Geobacter es el organismo más abundante, independientemente de la fuente del inóculo20. G. sulfurreducens reduce los aceptores de electrones con una amplia gama de potenciales redox estimados21,22 (−0,17 [goetita] a +0,98 V frente a SHE [paladio]), produce una densidad de corriente relativamente alta en sistemas de ingeniería (hasta 10 A ∙ m-2)23, y tiene una red compleja de transportadores de electrones5,22,24,25. Para adaptarse a medida que cambia el potencial redox de su aceptor de electrones, G. sulfurreducens expresa al menos tres vías de transferencia de electrones diferentes, cada una de las cuales tiene una condición de crecimiento óptima y una señal electroquímica distinta3,5,22,25. Por estas razones, G. sulfurreducens se considera un organismo electroactivo modelo26.

Las bacterias reductoras de metales como G. sulfurreducens pueden operar en un nicho de energía relativamente limitada. Los minerales oxidantes de acetato y reductores de hierro (III) natural de G. sulfurreducens pueden tener tan solo 0,12 voltios de diferencial redox en el caso de la goethita27, frente a ~1,1 V para la oxidación aeróbica de acetato. En las biopelículas electroactivas, G. sulfurreducens experimenta un gradiente de potencial redox ya que las células en la región externa de la biopelícula tendrán un potencial efectivo más bajo debido a la impedancia en la matriz de la biopelícula28. La capacidad de G. sulfurreducens para adaptarse a condiciones redox variables depende de una red compleja de transportadores de electrones. Este metabolismo flexible depende estrictamente de los procesos de membrana; la cadena de transporte de electrones de la membrana interna en G. sulfurreducens requiere diferentes proteínas transportadoras de electrones que dependen de la cantidad de energía disponible para la célula, es decir, el potencial redox del aceptor terminal de electrones5,22,29,30. Cuando la energía está limitada por aceptores de electrones con bajos potenciales redox, el crecimiento de G. sulfurreducens podría verse limitado tanto por una menor tasa de respiración según la cinética de Nernstian28,31 como por un menor rendimiento de generación de ATP por electrón respirado. El efecto es un metabolismo respiratorio limitado por la membrana. Esta limitación da como resultado una disminución del crecimiento y la tasa respiratoria de G. sulfurreducens que crece en aceptores de electrones de bajo potencial redox29,32.

En este trabajo hemos descubierto estructuras ICM en G. sulfurreducens. Utilizamos microscopía confocal, microscopía electrónica de transmisión (TEM) de sección delgada incrustada en plástico y tomografía electrónica criogénica (CryoET) para identificar estructuras ICM en G. sulfurreducens que están localizadas en regiones subcelulares específicas. Al observar las células en diferentes condiciones redox, podemos probar la hipótesis de que la ICM en G. sulfurreducens está asociada con condiciones termodinámicas en las que las células deben respirar a bajo potencial. Estas observaciones tienen implicaciones significativas para la comprensión holística de la respiración en condiciones de energía limitada.

En secciones de plástico delgadas preparadas mediante sustitución por congelación de células congeladas por inmersión, observamos estructuras ICM en células de G. sulfurreducens recolectadas de una biopelícula que se cultivó en un ánodo a -0,07 V frente a SHE. Los ICM aparecen principalmente como bandas paralelas de membrana en el citoplasma y se localizan en una fracción del volumen total de la célula (Fig. 1). En algunos casos, los ICM también se observaron como estructuras curvas o circulares. En la mayoría de los casos, cuando la sección TEM mostraba la longitud total de la celda, los ICM aparecían principalmente hacia una de las puntas de la celda (Fig. 1b, d). No encontramos células con ICM en más de un área del citoplasma, y ​​no todas las células en nuestras secciones plásticas tenían evidencia de la estructura. Repetimos el procedimiento de seccionamiento plástico con células cultivadas con fumarato, un aceptor de electrones soluble con un potencial redox más alto (E'0 = 0,03 V frente a SHE), y no encontramos evidencia de ICM en las micrografías resultantes (Fig. 1 complementaria) .

Micrografías TEM incrustadas en plástico congeladas y congeladas de G. sulfurreducens recolectadas de una biopelícula de ánodo preparada a -0,07 V frente a SHE. Las estructuras ICM se presentan como bandas paralelas en un área de una célula. a, c y e muestran ICM en celdas cortadas perpendicularmente al eje principal, mientras que b, d y f muestran ICM en celdas cortadas paralelas al eje principal donde el ICM se encuentra cerca de la punta de la celda. Las micrografías se recogieron en un FEI TF20. Barras de escala: 100 nm.

El TEM incrustado en plástico convencional se ha utilizado para caracterizar los MCI bacterianos durante más de 50 años33. El ICM de G. sulfurreducens comparte algunas características morfológicas con estructuras descritas previamente en otras bacterias. Las bacterias oxidantes de amoníaco (AOB) pueden producir ICM con una membrana continua plegada firmemente en bandas paralelas localizadas en un área de la célula, aunque el ICM en AOB parece ocupar una fracción mayor del volumen celular en comparación con lo que observamos en G. azufrereducens33. El ICM en AOB se forma a partir de la invaginación de la membrana interna33. En AOB Nitrosomonas eutropha, el desarrollo de ICM es estimulado por condiciones de oxidación de amoníaco, pero ICM no se desarrolla durante la desnitrificación anóxica34. De manera similar, observamos la producción de ICM en G. sulfurreducens en respuesta a ciertas condiciones ambientales redox. En G. sulfurreducens, aún no hemos determinado el mecanismo de señal que activa la expresión de ICM o si hay proteínas de tipo citoesquelético involucradas en su organización.

Usando CryoET de células enteras, observamos ICM sin los artefactos y el daño de la membrana comúnmente introducido por la deshidratación35. Cultivamos G. sulfurreducens adherida directamente a rejillas TEM con la rejilla misma sirviendo como ánodo en una celda electroquímica seguida de vitrificación inmediata. Las reconstrucciones de células de G. sulfurreducens muestran ICM que no están tan apretados y regulares como lo que observamos con la sección de plástico TEM (Figs. 2, 3). La diferencia en la apariencia de ICM entre cryoET y TEM de sección delgada incrustada en plástico podría estar relacionada con artefactos del proceso de deshidratación antes de la incrustación, o debido a una diferencia en la etapa de crecimiento de la biopelícula. CryoET reveló que el ICM en G. sulfurreducens tiene una variación significativa en la morfología. En algunas células, el ICM es una masa poco organizada de estructuras de membrana (Fig. 3), pero en otras es más regular y está compuesto por unidades más pequeñas (Fig. 2). Esta variación puede representar diferentes etapas de desarrollo de la estructura, ya que las muestras de criotomografía se tomaron solo después de 24 h de introducir una rejilla EM en la celda electroquímica, mientras que las imágenes TEM de sección plástica capturan células que se recolectaron de una biopelícula completamente desarrollada. Los ICM, tal como se observaron en los criotomogramas, estaban estrechamente asociados a la membrana interna en la mayoría de los casos y, por lo general, cerca de la punta de la célula (Fig. 2).

un corte de tomograma que ilustra cómo se crearon modelos 3D a través de la segmentación de tomograma de ICM ubicado en la punta de una célula de G. sulfurreducens con la membrana interna, la membrana externa, ICM y varios nanocables modelados a partir del tomograma. La barra de escala es de 100 nm. b–d modelos 3D de tres celdas separadas que muestran ICM cerca de la punta de cada celda. Estas células se cultivaron a −0,07 V frente a SHE directamente en una rejilla.

Cortes de criotomografía y modelo 3D de una célula de G. sulfurreducens cultivada a –0,17 V frente a SHE en una rejilla crio-EM de oro/carbono perforado como ánodo durante 24 h. Criotomografía muestra cómo ICM parece formarse por invaginación de la membrana interna. Arriba: cortes de tomograma seleccionados en el eje z que muestran secciones de la invaginación. Abajo: modelo 3D de la membrana interna y la membrana externa a través (abajo a la izquierda) de todo el espesor del volumen modelado y (abajo a la derecha) el modelo cortado aproximadamente por la mitad en el eje z para mostrar el perfil ICM a una profundidad diferente. Barra de escala: 100 nm.

Los nanocables de proteínas son importantes para la respiración de G. sulfurreducens36,37. Observamos nanocables de proteínas extracelulares en la mayoría de los criotomogramas que recolectamos, pero no está claro si existe una relación directa entre los nanocables y los ICM (Fig. 2, Videos complementarios 1-5). Algunos nanocables se cruzan con la membrana exterior cerca de las ubicaciones del ICM, pero otros no. Como se espera que el ICM sea un área de alta actividad metabólica, la ubicación de los nanocables para la transferencia de electrones extracelulares podría ubicarse preferentemente cerca de esta área.

En una muestra cultivada con un ánodo de potencial más bajo (−0,17 frente a SHE), podemos observar una supuesta etapa de desarrollo de ICM más temprana (Fig. 3). Se muestra claramente que el ICM se forma por invaginación de la membrana interna, lo que es consistente con la formación de ICM en otras bacterias (p. ej., Rhodobacter sphaeroides)38,39. Si bien es evidente una red ICM compleja, una inspección minuciosa muestra que todas las secciones están interconectadas con el espacio citoplásmico dentro de ellas. Por lo tanto, es una invaginación continua de la membrana interna. Lo que es más importante, el espacio periplásmico es continuo y proporciona un camino hacia la membrana externa desde todas las regiones del ICM. Este espacio periplásmico continuo es crucial para el metabolismo de la respiración extracelular de G. sulfurreducens, donde los electrones de la membrana interna deben transportarse extracelularmente, pasando a través de los citocromos periplásmicos en el camino40,41. Se ha predicho que G. sulfurreducens tiene un periplasma más ancho que otras bacterias debido a su proteína Lpp más grande42. Medimos la distancia periplásmica desde la membrana interna a la externa en tomogramas de cinco células G. sulfurreducens diferentes y encontramos una distancia periplásmica de aproximadamente 40 nm (95 % IC [38.4,40.2], n = 128 mediciones, Fig. 2 complementaria), que es mayor que la distancia periplásmica de 30-32 nm encontrada en E. coli en otro estudio42.

También podemos identificar la presencia de ICM en G. sulfurreducens con microscopía confocal. Se ha utilizado una técnica similar para identificar ICM en metanótrofos43. Tomamos imágenes confocales de células de biopelícula fijas de G. sulfurreducens cultivadas a diferentes potenciales de ánodo o de suspensiones celulares cultivadas con fumarato como aceptor de electrones, y cada imagen tenía numerosas células individuales (Tabla complementaria 1). El ICM es un área brillante localizada dentro de una célula cuando se tiñe con rojo Nilo, un tinte fluorescente selectivo de lípidos44. Algunas células tienen un solo ICM, mientras que otras tienen múltiples regiones distintas de ICM (Fig. 4b). Generalmente, los ICM están ubicados cerca de las puntas de las celdas, pero también observamos ICM en ubicaciones a lo largo de una celda. Al usar el complemento MicrobeJ45 de ImageJ, podemos detectar los límites de las celdas y los máximos locales dentro de ellos que hemos identificado como ICM. El área ICM como fracción del área total de la celda tuvo un valor medio del 5,7 % en la biopelícula del electrodo cultivada a -0,07 V y del 4,2 % en las celdas de fumarato, pero existe una gran variación en el área fraccional con algunas celdas que tienen más del 30 %. del área ocupada por ICM (Figs. Suplementarias 3,4). Esto es más bajo que el área celular ocupada por los ICM en los metanótrofos43. Al aplicar un análisis de imagen idéntico (recuento de ICM) a las células recolectadas en diferentes condiciones, encontramos que un cambio en el aceptor de electrones afecta significativamente la frecuencia de las células de G. sulfurreducens que muestran ICM (Fig. 4a). En biopelículas cultivadas en ánodos a potenciales más altos, observamos una fracción relativamente menor de células con ICM (41 ± 4 % a -0,03 V frente a SHE frente a 58 ± 8 % a -0,17 V frente a SHE). Las células cultivadas con fumarato tuvieron la incidencia más baja de ICM (14 ± 10 %) a pesar de que la pareja redox fumarato/succinato tenía un potencial de alrededor de +0,03 frente a SHE, similar en potencial redox a nuestro potencial de ánodo más alto estudiado. En una biopelícula, sin embargo, habrá un gradiente de potencial redox debido a las pérdidas óhmicas y las limitaciones de difusión23,46,47, por lo que anticipamos que las células cultivadas con fumarato experimentarán un potencial redox más alto en promedio que las células de biopelícula de ánodo en un electrodo a un potencial similar. Dado que los potenciales de ánodo más bajos proporcionan menos energía potencial para el crecimiento25, la mayor abundancia de ICM puede ser una adaptación a la limitación de energía. Nuestro análisis de imágenes utilizó parámetros conservadores para identificar ICM dentro de las células, por lo que la frecuencia absoluta de ICM es probablemente más alta.

a Fracción de células con ICM en G. sulfurreducens en diferentes condiciones de crecimiento. Cada punto representa una imagen única con un promedio de 113 celdas, consulte la Tabla 1 complementaria para obtener recuentos sin procesar. Los tres potenciales, −0.17, −0.07 y +0.07, representan células recolectadas de ánodos equilibrados en los potenciales respectivos frente a SHE. Las células en condición de "fumarato" se cultivaron planctónicamente con fumarato como aceptor de electrones. La prueba estadística consistió en una prueba t de dos colas con corrección de comparación múltiple de Hochberg. *(ρ < 0,05), ***(ρ ≤ 0,001), ****(ρ ≤ 0,0001). b Proyección de suma de pilas z confocales de células de G. sulfurreducens cultivadas en un electrodo a -0,07 V frente a SHE con ejemplos de ICM anotados. c Proyección de la suma de células cultivadas con fumarato como aceptor de electrones que ejemplifica la morfología celular típica cuando ICM no está presente. Ambas imágenes de las células se recortan de imágenes más grandes tomadas con un aumento de 100X usando Nile red como un fluoróforo selectivo de fosfolípidos. Vea las inserciones ampliadas en la Fig. 5 complementaria.

G. sulfurreducens tiene un metabolismo respiratorio complejo y eficiente. En la membrana interna, los electrones se trifurcan en diferentes vías de respiración según el potencial redox del aceptor terminal de electrones3,5,22. Al ser una invaginación de la membrana interna, el ICM debe contener los citocromos de la membrana interna críticos para la respiración. En las bacterias oxidantes de amoníaco y metano, las enzimas respiratorias limitantes de la velocidad (amoníaco monooxigenasa y metano monooxigenasa, respectivamente) están presentes en el ICM15,17. Para organismos con márgenes termodinámicos delgados, un ICM podría permitir una mayor tasa de respiración al aumentar el área de superficie de la membrana y el número total de proteínas respiratorias. Producir un ICM debe ser una inversión de energía significativa para una célula, y la organización estructural del ICM en G. sulfurreducens sugiere una función especializada fuera del almacenamiento de lípidos. La producción de ICM explica por qué G. sulfurreducens tiene un mayor contenido de lípidos que otras bacterias Gram-negativas48, ya que la producción de ICM en otras bacterias provoca fracciones lipídicas elevadas43,49.

En nuestro estudio, encontramos una mayor incidencia de ICM en células que crecen con condiciones termodinámicamente menos favorables (Fig. 4a), en consonancia con el uso de un ICM para aumentar la frecuencia respiratoria en condiciones limitantes. Un ICM respiratorio en G. sulfurreducens requeriría un mecanismo para pasar electrones al resto de la red de transferencia de electrones extracelular, y si hay una conexión abierta con el periplasma, como se muestra en la Fig. 3, los electrones podrían transferirse por difusión de citocromos periplásmicos. (p. ej., PpcA, GSU1996)40,50. Sin embargo, el transporte de estos citocromos desde los ICM a la membrana externa sería una distancia mucho mayor que el espacio periplásmico típico, ya que los ICM parecen abarcar todo el grosor de la célula y tienen regiones que están hasta a 200 nm de la membrana externa.

Si bien G. sulfurreducens no es la única bacteria con un ICM, no se ha encontrado nada parecido al ICM en ningún organismo estrechamente relacionado. Hasta donde sabemos, es el primer organismo del filo Thermodesulfobacteriota identificado para producir un ICM, el primer reductor de óxido metálico que lo hace y la primera documentación de ICM formados en biopelículas. El ICM en G. sulfurreducens brinda una buena oportunidad para estudiar la formación de ICM en general, porque podemos controlar fácilmente su expresión cambiando el potencial redox del aceptor de electrones, y la localización polar del ICM en la punta presenta una oportunidad para estudiar intracelular Organización en bacterias. La producción variable de ICM en G. sulfurreducens sugiere que esta estructura se forma naturalmente para aumentar la frecuencia respiratoria en condiciones termodinámica y cinéticamente limitantes, una hipótesis que se ha propuesto antes para otros microorganismos8. A diferencia de otras bacterias que producen ICM, G. sulfurreducens no puede completar toda su vía respiratoria dentro del ICM. Los electrones del ICM en G. sulfurreducens deben viajar a la membrana externa para la respiración extracelular, y es posible que esos electrones tengan que viajar micras a través de una biopelícula antes de llegar al aceptor de electrones terminal

G. sulfurreducens tiene varios enfoques para optimizar la conservación de energía en condiciones redox limitantes y variables. Tres vías caracterizadas parecen expresarse concomitantemente dentro de una biopelícula electrogénica para maximizar la conservación de energía51. La generación de ICM en condiciones de limitación de energía parece ser una herramienta adicional para maximizar la producción de energía dentro de la celda. Los modelos nernstianos que se utilizan para predecir las tasas de respiración en G. sulfurreducens predecirían una tasa de respiración lenta a potenciales más bajos28,31,52 La tasa de respiración más lenta es la consecuencia de una proteína de transferencia de electrones limitante de la tasa, propuesta para estar en la membrana interna28 ,53. Si G. sulfurreducens puede aumentar la cantidad de esta proteína limitante de la frecuencia al aumentar la cantidad de membrana interna presente, se alivia la limitación aparente y se pueden lograr frecuencias respiratorias más altas. Por lo tanto, el conocimiento de cómo se utilizan los ICM y en qué condiciones se producen será importante para predecir las tasas de generación de corriente eléctrica por parte de G. sulfurreducens. Es probable que los estudios futuros de G. sulfurreducens ICM aprovechen las herramientas genéticas que se han desarrollado para el organismo, así como las técnicas de imagen creativas.

G. sulfurreducens PCA (ATCC, Virginia, EE. UU.) se cultivó a partir de stocks congelados de glicerol utilizando fumarato o un electrodo como aceptor de electrones25. Las células de fumarato se cultivaron en tubos de cultivo anaerobios sellados con medio ATCC 1957 que contenía 1,5 g de NH4Cl, 0,6 g de NaH2PO4, 0,1 g de KCl, 2,5 g de NaHCO3, 0,82 g de acetato de sodio, 8 g de fumarato de sodio y 10 ml de cada una de las soluciones de vitaminas y minerales de Wolfe. por litro de agua que se burbujeó con gas antes de sellar y esterilizar en autoclave. Se usó una mezcla de gases de 80/20 % N2/CO2 en todas las condiciones para eliminar el oxígeno del medio y mantener un pH cercano a 7. Las celdas de electrodo se cultivaron usando el mismo medio sin fumarato en celdas electroquímicas microbianas de una sola cámara de 100 ml en 6- Electrodos de grafito de 8 cm2 (Graphitestore, Illinois, EE. UU.) preparados a -0,17, -0,07 o +0,07 V frente a SHE. La corriente eléctrica fue monitoreada con un potenciostato VMP3 (BioLogic, Tennessee USA). Las botellas del reactor se llenaron con medio, se esterilizaron en autoclave a 121 C y luego se burbujearon con gas para eliminar el oxígeno antes de la inoculación. Cada reactor tenía un electrodo de referencia Ag/AgCl (BASi, Indiana USA).

Células de G. sulfurreducens de una biopelícula madura (~30 días de crecimiento) se fijaron en tampón de fosfato que contenía paraformaldehído al 4 %, glutaraldehído al 2 % (v/v) y luego se congelaron por inmersión en propano líquido antes de la deshidratación mediante sustitución por congelación en tetróxido de osmio al 2 %. disuelto en acetona sobre hielo seco a -80 °C. Las células se devolvieron lentamente a temperatura ambiente para incluirlas en resina Araldite 502 (Ted Pella, Inc.). Estas secciones se cortaron con un grosor de 70 nm y se tiñeron secundariamente con acetato de plomo para mejorar el contraste. Todas las imágenes de sección delgada se realizaron en un Tecnai TF-20 (FEI) o un Phillips CM12.

Para cultivar células de biopelícula de electrodos para cryoET, diseñamos un soporte para rejillas TEM de carbono fenestradas para insertarlas en células bioelectroquímicas con cultivos en crecimiento activo. Las rejillas del soporte se sujetan contra una placa de titanio que funciona como ánodo y aceptor de electrones para las bacterias. Las referencias de nanopartículas de oro conjugadas con BSA de 6 nm se secaron y luego se hornearon a 60 °C para fijar las referencias de oro en las rejillas antes de introducirlas en el biorreactor. Las rejillas TEM en el soporte se retiraron después de 24 h y se sumergieron inmediatamente en etano enfriado con nitrógeno líquido utilizando un congelador de inmersión manual diseñado internamente para capturar las células en su estado activo (Figuras complementarias 6, 7). Para la condición de fumarato, se pipeteó una suspensión de células cultivadas durante 7 a 10 días en cada rejilla, se secó para eliminar el exceso de líquido y se congeló con el FEI Vitrobot Mark IV.

Se tomaron imágenes de las células hidratadas congeladas en un Krios G2 (FEI, Oregón, EE. UU.) con inclinaciones de −65° a +65° en pasos angulares de 2,0° usando un esquema de recolección de dosis simétrica54 en regiones donde se podían observar células individuales sobre fenestraciones en el carbón. Las imágenes se recogieron con un aumento nominal de 6500x, lo que dio un tamaño de píxel de 1,8 Å en modo de superresolución en la cámara cumbre K2 con una tasa de dosis de 0,5 electrones por Å2 * segundo durante tres segundos con una tasa de fotogramas de 0,2 fotogramas por segundo (total dosis de 100 electrones por Å2). Los cuadros de película individuales se corrigieron, se alinearon con MotionCor255 y las imágenes sumadas se agruparon por 2, lo que resultó en una imagen con una escala de 3,6 Å/píxel. Las imágenes sumadas se reapilaron y luego se realizó la reconstrucción tomográfica en eTOMO56. Los cortes de cada tomograma se generaron desde IMOD utilizando la función de guardado de ventana ZAP, que guarda en la resolución nativa del monitor. El modelado 3D se realizó en IMOD y se visualizó en ChimeraX57.

Las células de biopelícula de ánodo de G. sulfurreducens se resuspendieron, fijaron y tomaron imágenes entre 12 y 20 días después de que la corriente comenzara a crecer exponencialmente y fuera de al menos 2 A/m2. Las células de biopelícula de G. sulfurreducens se retiraron del electrodo agitando suavemente en vórtex en tampón de fosfato, se sedimentaron a 4000 xg durante 5 min, se resuspendieron en paraformaldehído al 4 % durante 1 h, luego se enjuagaron y se almacenaron en tampón de fosfato a 7 °C. Se tomaron imágenes de células vivas de G. sulfurreducens cultivadas en condiciones de fumarato 5-7 días después de la inoculación. Las células en condiciones tanto de ánodo como de fumarato se diluyeron con tampón de fosfato 50 mM para la tinción de lípidos con rojo Nilo (ThermoFisher/Invitrogen, rojo, excitación: 561 nm) hasta una concentración final de 2 µg/ml. Las muestras se dejaron incubar durante al menos 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se tomaron imágenes de las células teñidas en un portaobjetos de vidrio estándar o en un portaobjetos de vidrio recubierto con poli-L-lisina al 2% con un cubreobjetos de 1 ½ sellado con esmalte de uñas.

Las imágenes de fluorescencia se adquirieron con un microscopio confocal Nikon C2 + equipado con un objetivo de aceite 100X Plan Apo λ (NA 1.45) utilizando el software NIS Elements adyacente, operado dentro de una guantera anaeróbica. El rojo Nilo se excitó con un láser de 561 nm y se filtró con un cubo de filtro 525/50 561 LP.

Las pilas Z se procesaron en proyecciones de suma y se aplicó un filtro de desenfoque gaussiano (σ = 1) para suavizar en ImageJ. El complemento ImageJ MicrobeJ45 se usó para la detección bacteriana e ICM de células de G. sulfurreducens en condiciones tanto de ánodo como de fumarato con resultados resumidos en la Tabla complementaria 1 y parámetros de análisis en la Figura complementaria 8. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student corregido para comparaciones múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Se puede acceder a los tomogramas utilizados para crear figuras para este manuscrito en el depósito de EMDB-EBI con los números de acceso EMD-27710, EMD-27729, EMD-27748 y EMD-27747.

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La financiación de este trabajo fue proporcionada por la Oficina de Investigación Naval (premio ONR N0014-20-1-2269). La microscopía confocal se realizó en una Nikon C2+ obtenida a través de una subvención ONR DURIP N00014-19-1-2531. Toda la microscopía electrónica se realizó en las instalaciones centrales de microscopía electrónica de ASU. La manipulación del modelo 3D se realizó parcialmente con UCSF ChimeraX, desarrollado por Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics de la Universidad de California, San Francisco, con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud R01-GM129325 y la Oficina de Infraestructura Cibernética y Biología Computacional, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas.

Escuela de Ingeniería Sostenible y Medio Ambiente Construido, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ, EE. UU.

Ethan Howley

Escuela de Ingeniería de Transporte Masivo y Energía, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ, EE. UU.

Anna Mangus y César I. Torres

Centro de Materiales Eyring, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ, EE. UU.

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EH planeó y realizó experimentos, creó figuras, escribió el primer borrador del manuscrito y editó el manuscrito; AM planificado y realizado la microscopía confocal; DW realizó criotomografía; CT aseguró la financiación, planificó el estudio y editó el manuscrito.

Correspondence to César I. Torres.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Howley, E., Mangus, A., Williams, D. et al. Las membranas intracitoplasmáticas se desarrollan en Geobacter sulfurreducens en condiciones termodinámicamente limitantes. npj Biofilms Microbiomes 9, 18 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00384-6

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Recibido: 05 Octubre 2022

Aceptado: 17 de marzo de 2023

Publicado: 07 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00384-6

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