Membrana nanoporosa magnética electrodepositada para alta | Orgullo Co., Ltd de Nanning del pavo real

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1358 (2022) Citar este artículo

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Las nanoesferas superparamagnéticas ofrecen varias ventajas sobre las microesferas para la inmunocaptura de nanoportadores (vesículas extracelulares, lipoproteínas y virus) en un bioensayo: captura de alto rendimiento, reducción del tiempo de incubación y mayor capacidad de captura. Sin embargo, las nanoesferas son difíciles de "bajar" porque su característica superparamagnética requiere altos gradientes de campo magnético a nanoescala. Aquí, se muestra que una membrana electrodepositada con huella grabada produce un anillo de nanoborde superparamagnético único con múltiples bordes alrededor de los nanoporos. Con un campo magnético externo uniforme, el monopolo y el dipolo inducidos de esta unión de borde nano se combinan para producir una fuerza de captura de nanoesferas 10 veces mayor. Una suspensión densa de nanoperlas se puede filtrar a través de la membrana nanoporosa magnética (MNM) con un alto rendimiento y una tasa de captura de perlas del 99 %. El rendimiento de nanoportadores específicos en medios heterogéneos por nanoperlas/MNM supera el 80 %. También se demuestran la reproducibilidad, las bajas pérdidas y las tasas de captura independientes de la concentración. Por lo tanto, este material MNM amplía la aplicación de la inmunocaptura de nanoesferas a muestras fisiológicas.

Las vesículas extracelulares (VE) y las lipoproteínas son nanopartículas biológicas que se pueden encontrar en diversos fluidos biológicos1,2,3. Su función recientemente descubierta de entregar carga molecular entre las células ha catalizado una actividad de investigación considerable en muchos campos4,5. Estos nanoportadores biológicos pueden ser mediadores críticos de la comunicación intercelular6,7. Por lo tanto, los vehículos eléctricos específicos, las lipoproteínas y sus cargas moleculares también son biomarcadores potenciales de enfermedades8,9,10. Sin embargo, estos biomarcadores a menudo no son exclusivos de las células enfermas, sino que simplemente se sobreexpresan. En consecuencia, se requiere una cuantificación precisa. Debido a su tamaño y heterogeneidad, el aislamiento de alto rendimiento de lipoproteínas y vehículos eléctricos específicos sigue siendo un desafío y puede introducir un sesgo sustancial en el ensayo de biomarcadores11,12,13,14,15. Los vehículos eléctricos y las lipoproteínas también tienden a degradarse, agregarse o adsorberse en muchos dispositivos16,17. Por lo tanto, se prefiere el aislamiento inmediato y de contacto corto a la separación por citometría de flujo y cromatografía, cuyos procesos de pretratamiento/separación son largos y complejos. Por lo tanto, un método de aislamiento efectivo, rápido y accesible es un requisito previo para cualquier aplicación clínica que involucre vehículos eléctricos y lipoproteínas. Los avances en las tecnologías de captura de alto rendimiento son beneficiosos en muchos espacios biomédicos, incluso para la detección de virus o bacterias patógenos.

El método de aislamiento de EV y lipoproteínas más específico es la inmunocaptura;18,19,20 sin embargo, las tecnologías tradicionales de inmunocaptura, como la inmunoprecipitación (IP) y la cromatografía de inmunoafinidad, tienen problemas de bajo rendimiento debido a la saturación de la sonda y la pérdida de analitos. Si los nanoportadores están marcados con fluorescencia, los capturados por microesferas magnéticas pueden clasificarse y cuantificarse mediante citometría de flujo. Sin embargo, el proceso de etiquetado y aislamiento requiere mucho tiempo y puede requerir más de un día para lograr el rendimiento óptimo, lo que resulta en una pérdida significativa de nanoportadores. Sus rendimientos también están limitados por el largo tiempo de incubación (8 a 48 h) debido a la baja movilidad de las microesferas para la reacción de acoplamiento de transporte limitado. Una solución a los problemas de rendimiento y tiempo de incubación es utilizar perlas nanomagnéticas. Su gran área superficial por volumen proporciona más sitios de unión. Su tamaño más pequeño conduce a una mayor difusividad y un tiempo de incubación más corto (~30 min). Las perlas también pueden difundirse a través de una muestra fisiológica heterogénea para capturar objetivos específicos de nanopartículas que tienen movilidad reducida debido a la complejidad o agregación. Su gran área de superficie por volumen proporciona más sondas de unión por un factor igual a la proporción de radios de microperlas/nanoperlas (~100) para la misma concentración de peso de perla. Este aumento en el número de sondas puede conducir al agotamiento completo de todos los nanoportadores diana, particularmente si las sondas de anticuerpos tienen una alta afinidad, proporcionando así un rendimiento de unión de nanoportadores de órdenes de magnitud superiores.

Sin embargo, debido a su naturaleza superparamagnética, es difícil atrapar nanoesferas y sus nanoportadores capturados después de la inmunocaptura masiva. La fuerza magnética sobre las perlas superparamagnéticas es proporcional al gradiente del campo al cuadrado (dos veces el producto del campo y el gradiente del campo), mientras que la fuerza sobre una microperla magnética es proporcional al campo local. Para las trampas de microesferas magnéticas de uso común, el gradiente de campo se limita a menos de un radio de la microesfera y, por lo tanto, solo puede atrapar nanoesferas dentro de un área pequeña alrededor de la microesfera. Por lo tanto, se requiere una columna larga de perlas empaquetadas densamente para una captura de alto rendimiento. Por ejemplo, las columnas comerciales de microesferas (μColumn, Milyteni Biotec) para la captura de nanoesferas solo atrapan entre el 20 y el 30 % de las nanoesferas21. Es necesario atrapar repetidamente (> 4 ×) para producir> 90% de rendimiento. Una película magnética puede producir una longitud de penetración de campo mayor que una perla magnética debido a su geometría no focalizadora (no radial). Recientemente, Issadore y sus colegas desarrollaron una membrana nanoporosa recubierta de una capa magnética con un rendimiento de captura mejorado, pero aún se requieren múltiples capas de membranas para una captura eficiente de las perlas22. Aunque el campo es de largo alcance, el gradiente de campo no es para una película magnética plana, excepto en las esquinas. En nuestro trabajo anterior sobre campos eléctricos en microcanales23 y nanoporos24, mostramos que un campo eléctrico singular con un alto gradiente ocurre en el lado de alta permitividad (agua) de una esquina de cuña de un canal o un poro si el ángulo de cuña α de la la fase de mayor permitividad excede π. Este campo singular de cuña decae radialmente desde la punta de la cuña con una escala de ley de potencia de −(π/α) − 1 y, por lo tanto, también tiene un gradiente de campo alto. El exponente de decaimiento radial está limitado entre −2 de una esfera y −3/2 de un cilindro infinitamente largo. Este modo de cuña singular es antisimétrico alrededor de la cuña e introduce un dipolo en la fase de alta permitividad. Hay una singularidad de cuña de "pararrayos" más conocida en la plasmónica de campo cercano25,26,27 que es simétrica alrededor de la cuña, con el campo singular que ocurre en el lado de baja permitividad. Ocurre cuando el lado de alta permitividad tiene un ángulo de cuña menor que π. Introduce un monopolo en el lado de baja permitividad de la cuña. En este documento, ampliamos este concepto a los campos magnéticos para lograr una captura de alto rendimiento de perlas superparamagnéticas con un alto rendimiento. Diseñamos un nanoborde de NiFe superparamagnético de varios bordes con una unión heterogénea, cuyos bordes sostienen tanto un monopolo magnético como un dipolo alrededor de cada nanoporo de una membrana de polímero nanoporoso. Este enfoque aumentará significativamente el rendimiento de captura de una membrana al 99 % con un rendimiento de 5 ml/h para una única membrana nanoporosa magnética (MNM).

En comparación con el borde liso del poro que se forma durante la pulverización catódica, los bordes de la membrana electrochapada son más afilados para aproximarse a la geometría de la cuña. Por lo tanto, se utilizó galvanoplastia en lugar de pulverización catódica para la deposición de capas de Ni80Fe20 (Fig. 1a). Además, debido al alto campo en la unión de la película de Au durante la galvanoplastia, la película de NiFe envuelve la capa de oro pulverizada dentro del poro para formar la geometría de borde deseada para un dipolo. Los vehículos eléctricos no capturados pueden atravesar los poros rectos y recogerse en el flujo continuo (Fig. 1b). Probamos la eficiencia y especificidad de MNM usando lipoproteínas de alta densidad (HDL) como modelo y observamos que >80 % de HDL se recupera usando el método, casi duplicando la tasa de recuperación de los kits comerciales. También demostramos que MNM tiene un rendimiento alto y constante y, por lo tanto, puede proporcionar las estadísticas necesarias para cuantificar biomarcadores transportados por vehículos eléctricos y lipoproteínas en fluidos fisiológicos heterogéneos (Fig. 1c).

a Fabricación de la membrana nanoporosa magnética (MNM). En total, se depositaron 80 nm de Au sobre la película de PET grabada con seguimiento para proporcionar una buena adherencia y conductividad eléctrica para la galvanoplastia. Luego se depositó una película de NiFe de 200 nm sobre la membrana con galvanoplastia. En total, finalmente se depositó Au de 10 nm para reducir la adsorción no específica y la inestabilidad química. A la derecha: se resalta la unión heterogénea de nanobordes en el borde del nanoporo de la membrana. b Configuración de inmunocaptura basada en MNM. Primero, el anticuerpo y el antígeno se incubaron para formar un complejo Ab-Ag, seguido de la incubación con nanoesferas magnéticas, que se conjugaron con anticuerpos IgG anti-conejo. Luego, la muestra diluida se pasó a través de la cámara del dispositivo MNM con una jeringa y una bomba. El dispositivo MNM se ensambló con el MNM intercalado entre dos chips impresos en 3D. El dispositivo se ensambló entre dos imanes, con el imán cerca de la entrada en forma de anillo. Las perlas magnéticas se capturaron en el borde de los nanoporos, como se resalta. c Pasos experimentales de las tres aplicaciones. Se usaron anticuerpos anti-ApoA1 para capturar HDL; se usó una membrana de nanoporos asimétricos para aislar los EV, con una pequeña cantidad de HDL restante, y usamos MNM para eliminar el HDL residual para purificar la fracción de EV; En la fracción EV, se utilizó MNM para capturar el EV específico con una proteína de superficie particular, es decir, EGFR.

Debido a que el momento magnético de una nanoesfera superparamagnética es inducido por el campo externo, la fuerza sobre ella se describe mediante:

donde χeff es la susceptibilidad magnética efectiva de las perlas, V es el volumen de las perlas, μ y μ0 son la permitividad magnética del material y del vacío, y \(\vec{B}\) es el campo magnético. La fuerza magnética aumenta a medida que el gradiente del campo se eleva al cuadrado o el doble del campo multiplicado por el gradiente del campo. Por lo tanto, un gradiente de campo magnético alto, no solo un campo magnético alto, es la clave para lograr una alta recuperación de perlas. Tales gradientes altos se pueden introducir con geometrías agudas (cuñas y conos). Esta mejora geométrica del campo electromagnético se ha aplicado a una variedad de diseños de ingeniería, desde antenas a gran escala28,29 hasta nanoestructuras30,31. Anteriormente, usamos el campo eléctrico singular en el borde de microchannels23 y nanopores24 para atrapar coloides y translocar moléculas por dielectroforesis. Como se muestra en la Fig. 2a, c, el borde del nanoporo en la membrana pulverizada es suave. La capa de NiFe solo cubría la parte superior de la capa de Au debido a la naturaleza anisotrópica de la pulverización catódica. Apareció un borde más afilado en la membrana electrochapada debido al enfoque del campo eléctrico durante el enchapado (Fig. 2b, d). La diferencia geométrica también se puede observar desde la parte superior de las membranas (Fig. 2e, f). Se observa una cristalización más fina de la membrana electrochapada (Fig. 2f), en comparación con la membrana pulverizada (Fig. 2e), lo que sugiere que se puede lograr una esquina más nítida y un mayor gradiente de campo con la membrana electrochapada. La película de NiFe también creció dentro del poro para formar la unión heterogénea en cuña ya que, a diferencia de la pulverización catódica, la galvanoplastia también se produce en el lado de la película de oro de 80 nm. Bajo magnetización externa uniforme a 0,4 Tesla, se desarrolla un campo máximo de 0,62 Tesla y un gradiente máximo de densidad de flujo cuadrado de 2,3 × 105 T2/cm en la fase acuosa (Fig. 2h), en comparación con 0,48 Tesla y 2,2 × 104 T2/ cm para la película de NiFe pulverizada sin el anillo en cuña, lo que representa un aumento de diez veces en el campo de fuerza de la ecuación. (1).

Esquema de los nanoporos en (a) una membrana nanoporosa magnética pulverizada, y (b) una membrana nanoporosa magnética galvanizada, y se resalta el borde del nanoporo (se ignora la fina capa de oro final). c Imágenes SEM de sección transversal de un solo nanoporo en una membrana nanoporosa magnética pulverizada. Tenga en cuenta el borde liso de la capa de NiFe (azul). d Imágenes SEM de sección transversal de un solo nanoporo en una membrana nanoporosa magnética electrochapada. Tenga en cuenta el borde afilado de la capa de NiFe (azul). Imágenes SEM de la (e) membrana pulverizada y (f) membrana electrochapada. g Simulación de densidad de flujo magnético (T) en nanoporos en membrana nanoporosa magnética pulverizada ideal (superior) y membranas nanoporosas magnéticas galvanizadas ideales (inferior), que muestra la espectacular amplificación de la densidad de flujo en la cuña en el MNM electrochapado (espesor de membrana dejado para derecha: 200 nm, 150 nm, 100 nm). h Simulación del campo magnético, que muestra el gradiente del cuadrado estándar de densidad de flujo (T2/cm) en la cuña tanto en membranas nanoporosas magnéticas pulverizadas ideales (superior) como en membranas nanoporosas magnéticas galvanizadas ideales (inferior) (espesor de la membrana de izquierda a derecha: 200 nm, 150 nm, 100 nm).

La mejora de alto campo se origina en un monopolo de fase de agua en el borde superior de la película de NiFe, donde el ángulo de cuña en la fase de NiFe superparamagnético de alta permeabilidad es de aproximadamente π/2, y un dipolo en la fase de NiFe en el borde exterior en el base de la unión en cuña, donde el ángulo de cuña en el lado de NiFe es ~3π/2. Hay una amplificación adicional del campo dipolar al entrar en la fase de agua con una permeabilidad magnética 40 veces menor. En la membrana pulverizada, solo tenemos un monopolo superior débil debido al borde liso (Fig. 2g). Esta combinación del campo dipolo y monopolo en los bordes afilados de la película de NiFe galvanizada es responsable del aumento de 10 veces en la fuerza de captura de las nanoesferas, y esperamos observar un aumento similar en el rendimiento de captura para las nanoesferas superparamagnéticas.

Para probar la eficiencia de captura del MNM con la cuña superparamagnética de varios bordes alrededor de cada nanoporo, diseñamos un aparato de alojamiento para aplicaciones de inmunocaptura de MNM, que se describe en la Nota complementaria 3. Se probaron membranas redondas con 2 cm de diámetro durante los experimentos. . Brevemente, se pasó 1 ml de nanoperlas de 30 nm diluidas 10 × de Exosome Isolation Kit Pan (ratón, Miltenyi Biotec) a través de la membrana nanoporosa galvanizada de 450 nm (tamaño de poro de PET) a 1 ml/h. Para todos los experimentos, la cantidad de nanoperlas está por debajo del nivel de saturación del MNM. la figura 3b muestra la solución de perlas antes y después de la captura magnética en la membrana; el color marrón de las perlas desaparece por completo en la solución de flujo, lo que indica una alta eficiencia de captura de perlas. Las nanoperlas conducidas por líneas de corriente cerca de la superficie quedan atrapadas por el monopolo cerca del borde superior de la película de NiFe, como se muestra en la Fig. 3a. Las perlas restantes son convectadas hacia el centro del poro y quedan atrapadas por la fuerza magnética de alto dipolo dentro del poro (Fig. 3c). Se utilizó plasma de ratón sano para validar la capacidad de captura de EV del MNM (detalles en la Nota complementaria 4). La imagen SEM (Fig. 3d) muestra el exosoma de plasma de ratón acoplado con nanoperlas capturadas cerca del nanoporo.

una imagen SEM de perlas magnéticas capturadas cerca de los bordes de los nanoporos por el campo monopolar. El diámetro del poro ha disminuido a alrededor de 300 nm después de la deposición de diferentes capas metálicas. b Solución de perlas antes de pasar a través de la membrana nanoporosa magnética (izquierda) y después de filtrar a través de la membrana magnetizada (derecha). El color amarillo indica las perlas concentradas. c La imagen SEM ampliada muestra nanoesferas capturadas dentro de un solo nanoporo por el campo dipolar de la unión en cuña. d Imagen SEM del exosoma de plasma de ratón capturado cerca del nanoporo. e Eficacia de captura de perlas de membranas pulverizadas y galvanizadas a diferentes caudales y tamaños de poro. Para la membrana electrochapada, se probaron el tamaño de poro original de 450 nm y 1 μm y velocidades de flujo de 1, 5 y 10 ml/h. Para la membrana pulverizada, se probaron el tamaño de poro original de 450 nm y la velocidad de flujo de 1 ml/h (n = 3 experimentos independientes). Las barras de error indican las desviaciones estándar (SD) para cada condición.

El tamaño de los poros se reduce de 450 a aproximadamente 350 nm después de la galvanoplastia, que sigue siendo más grande que el tamaño pequeño típico de EV (sEV) de 30 a 200 nm, lo que permite el paso de EV no objetivo sin nanoperlas. Se realizó un estudio cuantitativo de la eficiencia de captura de perlas comparando la concentración de perlas medida por el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) antes y después de la captura (ver Fig. 3e). A 1 ml/h, se capturó >99 % de las perlas. La eficiencia de captura de perlas no disminuyó incluso a una velocidad de flujo de 5 ml/h. Este rendimiento es lo suficientemente alto para la mayoría de las aplicaciones de inmunocaptura de vesículas extracelulares. Además, solo se perdió el 13 % de las perlas cuando se aumentó la velocidad de flujo a 10 ml/h. Para membranas con un tamaño de poro de 1 μm, la eficiencia de captura de perlas seguía siendo >80 % a 1 ml/h. En marcado contraste, solo el 22% de las perlas fueron capturadas por la membrana de 450 nm pulverizada (Fig. 3e). Para vesículas más grandes por encima de 300 nm, se puede usar MNM galvanizado con un tamaño de poro de 1 μm a un caudal más bajo o con un campo magnético externo más alto.

Con base en la efectividad del MNM para capturar EV, buscamos investigar la capacidad de este método para capturar lipoproteínas, a saber, HDL (Fig. 4a). Las HDL son muy abundantes en el plasma y otros biofluidos y proporcionan un buen modelo para rastrear en función de los ensayos de colesterol estándar que se pueden usar para cuantificarlos. La apolipoproteína AI (apoA-I) es la principal proteína de estructura y función en la superficie de las partículas de HDL. ApoA-I se asocia principalmente con HDL y representa ~70% del contenido total de proteína HDL en masa. Las muestras de HDL se aislaron del plasma humano mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC) y los niveles de proteína total se cuantificaron mediante ensayos colorimétricos32. Para la captura, se mezclaron 2 μg de anticuerpos anti-ApoA-I (Abcam, ab52945, monoclonal de conejo contra ApoA1) con 100 μL de muestra de HDL de 100 μg/mL, se incubaron durante 30 min y se trataron con 100 μL de nanoperlas de IgG anti-conejo ( 30 nm, Milyteni Biotec) durante 1 h. Después de que las nanoesferas magnéticas inmunocapturaran la HDL, la solución se diluyó a 500 μL con 1 × PBS y se pasó a través de la membrana MNM galvanizada de 450 nm, seguido de un lavado con 1 ml de 1 × PBS para llevar todas las perlas a la membrana. superficie y eliminar la solución de HDL residual en la cámara. Se recogió el flujo continuo para cada muestra. Dado que el colesterol está presente solo en las lipoproteínas y no en los EV, se midió la concentración de colesterol para calcular la cantidad total de colesterol tanto en la muestra original como en el flujo continuo (Fig. 4b). La tasa de captura de colesterol se puede calcular de la siguiente manera:

a Esquema de la inmunocaptura de la tasa de captura de HDL utilizando el colesterol como medida. En los tres casos se probaron diferentes combinaciones para captura específica de HDL con anticuerpos anti-ApoA1 y captura no específica sin anticuerpos y anticuerpos anti-ApoB, que son específicos de LDL. b Tasa de captura de los tres casos en (a) (n = 3 mediciones en cada caso). c Comparación de la tasa de captura de HDL utilizando diferentes kits de inmunocaptura, incluidos Miltenyi MACSTM μColumn y Thermofisher DynabeadsTM. Los esquemas insertados muestran el principio de funcionamiento básico de diferentes tecnologías. Se eligió que el tiempo de incubación fuera de 1 h y de 16 h para Dynabeads™ (n = 7 mediciones para cada método). d Valor Ct de miR-21 de experimentos qRT-PCR. Las muestras de miARN se extrajeron de HDL capturadas por MNM y Dynabeads™ con el mismo volumen de muestra inicial (n = 3 mediciones para cada muestra). El tiempo de incubación del experimento MNM es de 1 h y el de Dynabeads™ es de 12 h. Los esquemas de la inmunocaptura y qRT-PCR se muestran en el recuadro. El HDL fue capturado por MNM o Dynabeads y luego lisado, seguido de extracción de miARN y qRT-PCR. Las barras de error indican la desviación estándar (SD) en cada gráfico.

Sorprendentemente, se recuperó >80% de HDL usando este enfoque. Para confirmar la especificidad de la inmunocaptura y adsorción no específica en nuestro dispositivo, se probaron dos controles negativos. Si no se funcionalizó ningún anticuerpo en las nanoesferas en los experimentos, se perdió <10 % de HDL en el dispositivo, lo que se debió a una adsorción no específica y a un error experimental. Cuando se utilizaron anticuerpos (Abcam, ab139401, monoclonal de conejo para ApoB) contra la apolipoproteína B, la proteína estructural de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), en lugar de anti-ApoA-I, la pérdida aumentó al 14%. La pérdida adicional del 4% puede provenir de la captura no específica de HDL por anti-ApoB. En ambos controles negativos, la tasa de captura no específica de <15 % es significativamente menor que la tasa de captura específica del 80 %. Comparamos nuestro método con un kit de inmunocaptura comercial utilizando su protocolo estándar (consulte la Nota complementaria 5). Como se muestra en la Fig. 4c, para las nanoperlas, la μColumn (Milyteni Biotec) capturó solo el 20 % de HDL debido a la baja eficiencia de captura de perlas de la columna empaquetada. Además, para microesferas como Dynabeads™, incluso después de 16 h de incubación, mucho más tiempo que el protocolo estándar, la eficiencia de captura de HDL no supera el 50 %. Durante el mismo tiempo de incubación de 1 h que las nanoesferas, solo se recuperó el 25 % de HDL (Fig. S4 complementaria), marginalmente >15 % de tasa de captura no específica.

Para demostrar aún más la ventaja del método de inmunocaptura MNM, la extracción de miARN y la cuantificación qRT-PCR de miR-21 se realizaron en HDL capturado tanto por MNM como por Dynabeads™. La Figura 4d muestra una diferencia de Ct de más de 6 entre los dos métodos de inmunocaptura, lo que sugiere que el resultado de expresión de miARN de Dynabeads™ es 64 veces menor que el de MNM (método delta-delta Ct). El largo tiempo de incubación que requieren las microesferas provoca la degradación de la muestra y la degradación de miARN y la adsorción, lo que conduce a un sesgo significativo en la cuantificación de miARN. Por el contrario, se conservó una alta concentración de miR-21 en la inmunocaptura rápida de MNM.

En esta demostración, primero se diluyeron 100 μL de plasma humano sano y se procesaron mediante filtración de flujo tangencial con membranas nanoporosas asimétricas de 30 nm33 para eliminar la mayor parte de las HDL y otras lipoproteínas (Fig. 5a). Como se muestra en la Fig. 5b, aún quedaba un 17 % de colesterol de la mayoría de LDL y VLDL después de la filtración. También podría estar presente una pequeña cantidad de HDL en la muestra filtrada debido a la cantidad dominante de HDL en el plasma original. Por lo tanto, mezclamos la muestra filtrada con 2 μg de anticuerpos anti-ApoA-I y 2 μg de anticuerpos anti-ApoB y la incubamos durante 30 min. Estas apolipoproteínas son específicas de las lipoproteínas pero no de los EV. Después de agregar 200 μL de microesferas IgG anti-conejo (30 nm, Milyteni Biotec) e incubar durante 1 h, la mezcla se pasó a través del MNM. El flujo continuo recolectado fue la muestra de EV purificada, que contenía el 85 % del EV original de la caracterización de NTA en la Fig. 5c, pero solo el 5 % del colesterol original. La distribución del tamaño de la muestra de EV también se conservó después de la purificación, como se ve en la Fig. 5c, lo que indica que MNM no solo retiene el 85% de los EV en número, sino que también evita la lisis o coalescencia de EV. Los resultados de ELISA para CD63 y CD9 en la Fig. 5c también confirmaron una pérdida mínima (13–17 %) antes y después de la purificación de MNM con procedimientos desplegables anti-ApoA-I y anti-ApoB.

un esquema del fraccionamiento EV y la inmunocaptura de HDL. El plasma diluido (muestra I) atraviesa la membrana nanoporosa asimétrica para eliminar otras partículas con un mecanismo de exclusión por tamaño, obteniendo así la fracción EV (muestra II). Debido a la cantidad dominante de HDL, una pequeña porción de HDL permaneció en la fracción EV, por lo que se incubó con anticuerpos anti-ApoA1 y anti-ApoB, y luego las nanoesferas magnéticas se conjugaron con anticuerpos IgG anti-conejo y se corrieron a través del dispositivo MNM. para eliminar el HDL, y se recogió el flujo continuo (muestra III). b Remanente de lipoproteínas (colesterol) en diferentes etapas de purificación de las muestras I, II, III en a), y (recuadro) concentración de EV antes y después de la inmunocaptura de MNM (muestra II y III) (n = 5 mediciones para cada muestra). c Distribución del tamaño de las muestras de EV con NTA antes (muestra II) y después de la inmunocaptura de MNM (muestra III) que muestra una pérdida mínima de EV o lisis/coalescencia. (recuadro) Concentración de CD63 y CD9 antes y después de la inmunocaptura con MNM (muestra II y III) medida por ELISA (n = 2 y 3 mediciones para CD63, CD9, respectivamente). Las barras de error indican la desviación estándar (SD) en cada gráfico.

Una importante dirección de investigación en el campo de los vehículos eléctricos es identificar los vehículos eléctricos secretados por células específicas (enfermas) o por vías específicas14. En este estudio, los vehículos eléctricos se aislaron por primera vez de células de cáncer colorrectal humano (DiFi) mediante una tecnología de separación ANM (membrana nanoporosa asimétrica) basada en el tamaño. Luego, el MNM aisló aún más los EV específicos con proteínas de membrana EGFR del aislado ANM EV para demostrar la cuantificación precisa de miARN de una subclase específica de EV (Fig. 6a). Según el análisis de los EV DiFi que contienen EGFR, los EV aislados probablemente eran exosomas según el contenido de tetraspanina34. Algunos de los EV liberados por las celdas DiFi exhibieron EGFR inactivo y EGFR34 activo. Utilizamos un anticuerpo EGFR total que captura EGFR tanto activo como inactivo en este experimento. Los sobrenadantes de cultivos celulares DiFi se procesaron primero mediante filtración de flujo tangencial con membranas nanoporosas asimétricas de 30 nm33 para eliminar las proteínas que flotan libremente. Brevemente, se añadió 1 μg de anticuerpos anti-EGFR a la muestra y se incubó durante 30 min. Después de agregar 100 μL de microesferas IgG antihumanas (30 nm, Milyteni Biotec) e incubar durante 1 h, la mezcla se pasó a través del MNM. Las transferencias de Western de sintenina-1 (como proteína EV15,35) y EGFR se llevan a cabo tanto en la fracción aislada de ANM como en la fracción capturada de MNM para validar el contenido de EV (Fig. 6e). Extrajimos miARN de todas las fracciones durante el proceso y realizamos qRT-PCR para evaluar los niveles de miR-21. La Figura 6b muestra el contenido de miARN dentro de los EV de EGFR aislados, y el material de flujo se suma por igual a los niveles totales de miR-21 en la muestra original con un error del 21 %, lo cual es insignificante si se tiene en cuenta que la qRT-PCR solo puede diferenciar dos cambios. La cantidad total de EGFR en el aislado ANM y el flujo continuo de MNM también se miden mediante ELISA. Se logró una caída cercana al 90 %, lo que indica que la mayoría de los EGFR se capturaron en el aislado MNM EGFR (Fig. 6b, recuadro). Las concentraciones de CD63 y CD9 dentro del aislado MNM EGFR están cerca de la mitad del total antes de la captura de MNM (Fig. 6c), lo cual es consistente con el resultado de miR-21 qRT-PCR (Fig. 6b). Para explorar más a fondo el potencial de cuantificación de nuestro sistema, hicimos el mismo experimento en muestras DiFi procesadas con ANM sin diluir y diluidas 8 veces. Como se muestra en la Fig. 6d, el cambio de 8,3 veces en el nivel de expresión de miR-21 coincide con el factor de dilución, lo que sugiere que nuestra alta eficiencia es consistente entre las diferentes concentraciones de muestras iniciales, lo cual es importante para los estudios cuantitativos de biomarcadores.

un esquema del fraccionamiento EV y la inmunocaptura de EV con EGFR. El medio de cultivo celular DiFi se pasó a través de la membrana nanoporosa asimétrica para obtener la fracción EV por separación de tamaño (muestra I), que luego se incubó con los anticuerpos anti-EGFR y luego nanoesferas magnéticas conjugadas con anticuerpos IgG antihumanos. Luego, las muestras pasaron a través del dispositivo MNM, con la muestra capturada en la membrana magnética mezclada con tampón de lisis (muestra II), y se recogió el flujo continuo (muestra III). b Nivel de expresión de Hm-miR-21 de diferentes fracciones de exosomas DiFi de las muestras I, II, III en (a) (n = 3 mediciones para cada muestra). (entrada) La cantidad total de EGFR se midió para I y III, lo que indica que la mayoría de los EV positivos para EGFR de los EV aislados en ANM son capturados por MNM (n = 7 mediciones para cada muestra). c Concentración de CD63 y CD9 del aislado ANM (muestra I) y el aislado MNM EGFR (muestra II) medidas por ELISA. (n = 3 mediciones para cada muestra) d Nivel de expresión de Hm-miR-21 en los exosomas EGFR antes y después de la dilución 8 × de las muestras DiFi y el valor Ct de sus resultados de qRT-PCR (n = 5 mediciones para cada muestra ). e Western blot de los vehículos eléctricos aislados de la línea celular DiFi. Después de Marker Lane, luego (1) sEV aislado por ANM; (2) sEV capturado por perlas de MNM. Cada pocillo se cargó con 40 µg de proteína. Exposición Odyssey (abajo: 10 min, arriba: sobreexpuesta). El panel superior está manchado por EGFR y el inferior por syntenin-1, respectivamente. Las barras de error indican la desviación estándar (SD) en cada gráfico.

Aquí, demostramos la utilidad y la eficiencia de MNM galvanizado con uniones superparamagnéticas heterogéneas únicas. Este método puede lograr una captura de alta eficiencia de nanoesferas superparamagnéticas. Logramos casi el 100 % de recuperación de nanoesferas de la solución a hasta 5 ml/h en un solo dispositivo. Los vehículos eléctricos no capturados pueden atravesar los poros rectos y recogerse en el flujo continuo. Probamos la eficiencia y especificidad de nuestro dispositivo utilizando HDL como modelo, con >80 % de partículas HDL recuperadas y una retención mínima no específica de menos del 15 %. El rendimiento alto y constante de nuestro sistema proporciona un potencial de cuantificación para estudios de vehículos eléctricos, lipoproteínas y otros transportadores de ARN extracelulares. Además, demostramos el rendimiento de MNM en la captura de exosomas, la purificación de muestras de EV enriquecidas con HDL y la caracterización de EV positivos para EGFR. El protocolo de lisis directa en este estudio es aplicable a una variedad de análisis posteriores para el descubrimiento y diagnóstico de biomarcadores, como qRT-PCR, proteómica basada en MS, secuenciación, etc. Para la administración de fármacos, ingeniería de tejidos y otras aplicaciones que requieren EV intactos como transportistas, es necesario un protocolo de liberación de vehículos eléctricos. Los tampones de disociación36,37, el enlazador fotoescindible38 y los enlazadores sensibles a proteasas39 son estrategias potenciales para separar los EV del MNM. Nuestra plataforma también es aplicable para otras aplicaciones de inmunocaptura molecular o de virus donde la eficiencia de captura y el rendimiento son esenciales. Además del aislamiento de vehículos eléctricos específicos del plasma para aplicaciones de biopsia líquida (detección de enfermedades y manejo de terapias), la tecnología MNM también debería ser útil para el descubrimiento de biomarcadores a partir de cultivos celulares, como hemos demostrado aquí para la muestra DiFi, y también para órganos. -modelos on-the-chip u organoides35,40,41,42.

COMSOL se utilizó para modelar y simular diferentes estructuras de nanoporos para estimar la densidad de flujo magnético y su gradiente. Se utilizó un modelo de geometría de simetría axial bidimensional (2D) con la interfaz Campos magnéticos, sin corrientes en el módulo CA/CC. Se utilizó la curva NiFe BH incorporada en el software. Se aplicó una densidad de flujo magnético estático de 0,5 T en el límite lejano del modelo. La simulación se llevó a cabo con una malla controlada por la física de elementos extremadamente finos. Se muestran más detalles en la Nota complementaria 1.

Las imágenes SEM de superficie se tomaron con Magellan 400. Para las membranas capturadas por EV, se usó una solución acuosa de paraformaldehído con calidad EMS al 2 % para la fijación, y se bombardeó con oro de 2 nm por adelantado para determinar la conductividad. Las vesículas se examinaron bajo energías de haz bajas. Las secciones transversales de los nanoporos se prepararon utilizando Helios G4 UX DualBeam (Thermo Scientific). Después de proteger la superficie de la sección transversal con Pt EBID, se obtuvieron secuencialmente cortes de 5 nm de espesor con el software Auto Slice & View™ 4 (AS&V4) que opera con un haz enfocado de 10 keV de iones de galio. El corte se detuvo en el centro del poro y las imágenes se adquirieron con un voltaje de 3 kV usando un detector TLD para electrones secundarios.

Las películas de PET con huella grabada usadas (PET115745, Wuwei Kejin Xinfa) tienen un grosor de 11 µm y una densidad de poros de 5 × 107/cm2. Para fabricar la membrana nanoporosa magnética electrochapada, se depositaron 80 nm de oro sobre las películas de PET grabadas en un evaporador FC-1800. La capa de oro proporciona una buena adhesividad entre el polímero y el NiFe y funciona como una capa semilla para la galvanoplastia. La membrana se cortó en piezas de 4 cm x 4 cm. Se utilizaron cintas de cobre para fijar las membranas al soporte y conectarlas eléctricamente al cátodo. Se usó una placa de níquel como ánodo. La solución de galvanoplastia adaptada de la literatura 43,44 se puede encontrar en la Nota complementaria 6. Se aplicó densidad de corriente constante a 2 mA/cm2 mediante Keithley 2636A Dual-Channel System SourceMeter; el voltaje es monitoreado durante el proceso de galvanoplastia. Se diseñó un tanque de agitación de galvanoplastia personalizado para una deposición uniforme. La tasa de deposición se derivó de imágenes SEM en muestras más gruesas cultivadas en las mismas condiciones. Se depositó otro Au de 10 nm en la parte superior de la capa de NiFe para reducir la adsorción no específica y la inestabilidad química. Las caracterizaciones adicionales de las membranas se detallan en la Nota complementaria 2.

Al igual que las muestras galvanizadas, inicialmente se depositó Au de 80 nm sobre las películas de PET. Las muestras pulverizadas se prepararon a temperatura ambiente en un sistema de pulverización UHV comercial Oerlikon DCSS utilizando un objetivo de Ni80Fe20. El flujo de gas Ar se fijó en 20 sccm y la potencia del plasma fue de 50 W durante la deposición. La tasa de deposición se derivó por medio de un perfilómetro de aguja e imágenes SEM en muestras más gruesas cultivadas en las mismas condiciones. Después de la pulverización catódica, se depositaron 10 nm de Au en la parte superior de la capa de NiFe.

Las muestras de plasma no identificadas se obtuvieron de Zen-Bio Inc. y consistieron en 10 ml de plasma humano fresco recolectado en tubos con coagulante EDTA. Cada muestra se analizó en busca de patógenos según lo exige la FDA. Todos los protocolos de ensayo realizados en estudios con participantes humanos cumplieron con los estándares éticos de la Universidad de Notre Dame.

Las células DiFi se cultivaron en un biorreactor FiberCell C2011 con poro de 20 kDa siguiendo las instrucciones del fabricante (FiberCell Systems, New Market, MD) utilizando medios libres de suero definidos por los sistemas FiberCell (CDM-HD). Específicamente, el biorreactor se lavó durante la noche con 1 × DPBS estéril (Corning, Corning, NY) y luego durante la noche con DMEM con alto contenido de glucosa (hgDMEM/Corning). El biorreactor se trató con 0,5 mg de fibronectina bovina (Sigma, St. Louis, MO) en 20 ml de DMEM durante 4 ha toda la noche. Luego, el biorreactor se lavó durante la noche con hgDMEM completo con suero de crecimiento bovino al 10 % (penicilina-estreptomicina al 1 % [Pen/Strep, GIBCO, Dublín/Irlanda], glutamina al 1 % [GIBCO], glutamina al 1 % [GIBCO], glutamina al 1 % [GIBCO], aminoácidos [GIBCO]). El biorreactor se cargó con 1–5 × 108 células DiFi en hgDMEM completo con suero al 10 % y se dejó reposar durante 1 h antes de hacer circular DMEM completo con suero al 10 %. Los niveles de glucosa se controlaron diariamente con un glucómetro (CESCO bioingeniería, Trevose, PA), y cuando los niveles de glucosa estaban a la mitad de los del medio inicial, se reemplazó la botella de medio. En los cambios de medios posteriores, el biorreactor pasó del 10 % de suero bovino al 5 % y luego al 3 %, antes de cambiar al medio CDM-HD (DMEM-HD) al 10 %. Una vez que las células se establecieron en DMEM-HD (al menos 2 semanas en DMEM-HD), se realizó una recolección rutinaria de medios acondicionados, extrayendo 20 ml de medios acondicionados por día. Los medios recolectados se centrifugaron a 2000 rpm para eliminar las células y cualquier desecho grande, luego una subfracción de los medios se filtró adicionalmente por gravedad a través de un filtro de jeringa Millex de poro de 0,22 µm (Millipore Sigma, Burlington, MA). Se agruparon al menos 3 días de colecciones de medios filtrados.

El plasma se recolectó de participantes humanos que dieron su consentimiento según los protocolos y la orientación activos de Vanderbilt IRB. La sangre se introdujo en tubos de recogida que contenían EDTA y se centrifugó inmediatamente para separar el plasma. HDL y LDL se aislaron del plasma humano mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad con KBr (DGUC), como se describió previamente32. Brevemente, LDL nativo (1,019–1,062 g/L) y HDL (1,063–1,021 g/L) se aislaron mediante DGUC secuencial utilizando una ultracentrífuga Optima XPN-80 con rotores SW41Ti o SW32Ti (Beckman–Coulter). HDL y LDL se dializaron en PBS con >4 cambios de tampón y se concentraron con filtros de corte de peso molecular de 3000 Da (Millipore). Los niveles de proteína total se determinaron para cada muestra de lipoproteína (HDL y LDL) mediante ensayos colorimétricos BCA (Pierce, ThermoFisher).

Las nanoesferas magnéticas se compran a Miltenyi y se usan tal cual. Estas nanoesferas tienen entre 20 y 30 nm (verificadas con SEM) y funcionalizadas con anticuerpos. Kit de aislamiento de exosomas Pan, ratón (n.° de cat. 130-117-039), microesferas IgG anti-conejo (n.° de cat. 130-048-602) y microesferas anti-IgG, humano (n.° de cat. 130-047-501) respectivamente para cada experimento.

Se usó el kit de ensayo de cuantificación de colesterol (Sigma-Aldrich, CS0005) para medir la concentración de colesterol de las muestras. Brevemente, se mezclaron 44 μL de tampón de ensayo, 2 μL de sonda, 2 μL de mezcla de enzimas, 2 μL de esterasa de colesterol y 50 μL de muestra y se incubaron a 37 °C durante 30 min en cada pocillo. Se estableció una curva de calibración para cada medición con muestras estándar con 0-5 μg de colesterol. Todas las muestras se diluyeron al rango de la curva de calibración con el tampón de ensayo. Se midió la absorbancia a 570 nm y se comparó con los estándares en la misma placa para determinar el colesterol total.

Los miARN se aislaron de las muestras utilizando el kit de plasma de miARN NucleoSpin® (Takara Bio) de acuerdo con el manual del fabricante. Primero se mezclaron 300 μL de la muestra con 90 μL de solución MLP y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 min, seguido de la adición de 30 μL de tampón MPP y 1 min de incubación a temperatura ambiente. Se añadieron al lisado 3,5 μl (1,6 × 108 copias/μl) de cel-miR-39-3p en agua libre de ARNasa como control añadido de normalización. Luego, la mezcla se centrifugó a 11.000 × g. Se tomó el sobrenadante y se mezcló con 400 μL de isopropanol. La mezcla se transfirió a la columna de unión y se centrifugó a 11 000 × g durante 30 s. Luego, la columna se lavó con 100 μL de MW1 y 700 μL de MW2 secuencialmente a 11 000 × g durante 30 s, seguido de 250 μL de MW2, lavado y secado a 11 000 × g durante 3 min. Finalmente, se agregaron 30 μL de agua libre de ARNasa para eluir el miARN a 11 000 × g durante 1 min después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 min. La transcripción inversa se llevó a cabo utilizando un kit miScript II RT (Qiagen). Se preparó una reacción de transcripción inversa de 20 μL con 2,2 μL de miARN eluido, 4 μL de tampón HiSpec 5 × miScript (Qiagen), 2 μL de mezcla de nucleicos 10 × miScript (Qiagen), 9,8 μL de agua libre de RNasa y 2 μL de transcriptasa inversa miScript Mezclar (Qiagen). La reacción se incubó a 16 °C durante 60 min, seguido de 95 °C durante 5 min. Luego, la reacción de transcripción inversa se diluyó con 200 μL de agua libre de RNasa. Se realizaron triplicados de las reacciones de qPCR con el kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen) y se ejecutaron en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus™ (Applied Biosystems). La reacción contenía 2 μL de cDNA diluido, 12,5 μL de 2· QuantiTect® SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen), 2,5 μL de 10· miScript Universal Primer (Qiagen), 10· miScript Primer Assay (Qiagen) para el miRNA objetivo y 5,5 μL Agua libre de ARNasa en un volumen final de 25 μL. Las mezclas de reacción se incubaron durante 15 min a 95 °C, seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s y 70 °C durante 30 s. Los valores de Ct se adquirieron y analizaron con el software StepOne™ v2.3 de acuerdo con las directrices MIQE45. Los valores de Ct de los miARN objetivo se ajustaron mediante el control estándar añadido (cel-miR-39-3p) agregado durante la extracción de miARN. El nivel de expresión se calcula mediante el método delta-delta Ct.

Se utilizaron el kit ELISA para EGFR humano (EGFR0, R&D Systems™), el kit ELISA para CD63 humano (n.º de cat. EH95RB, Invitrogen) y el kit ELISA para CD9 humano (n.º MBS7607059, MyBioSource) para cuantificar proteínas específicas en las muestras, respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. . Los marcadores de EV CD9 y CD63 seleccionados de las directrices MISEV201846 se detectaron en muestras de EV en concentraciones variables. Se establecieron curvas estándar para cada placa y las concentraciones de proteínas se determinaron mediante las lecturas.

Los Western blot se realizaron según el protocolo general descrito previamente47. Brevemente, las proteínas se cuantificaron mediante BCA (Thermo, Cat# 23235) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se cargaron cuarenta microgramos de proteína en cada carril de un gel de SDS-poliacrilamida al 11 % y se sometieron a electroforesis a 160 V durante aproximadamente 5 h. Las proteínas resueltas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa durante la noche a 4 °C a 25 voltios y luego se bloquearon con el tampón de bloqueo Intercept (Li-COR, Cat# 927-60001) durante 4–5 h. Las membranas de nitrocelulosa se cortaron en regiones de peso molecular para la transferencia en función del peso molecular aparente según lo marcado por los estándares de tamaño (Bio-Rad, n.° de catálogo 1610374). Se usaron anticuerpos EGFR (Millipore Rb, 1:1000, Cat#06-847) y Syntenin (Abcam, Rb, 1:5000, Cat# Ab133267) para las inmunotransferencias. Se cortó nitrocelulosa en la parte superior, media e inferior, respectivamente, para estos marcadores. A continuación, las transferencias se probaron con IRDye 800 CW anti-conejo de cabra secundario (LI-COR, 1:5000, Cat# 926-32213). Las membranas fueron desarrolladas por Odyssey (Li-COR).

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) se realizó con un NanoSight NS300 (NanoSight Ltd., Amesbury, Reino Unido) de acuerdo con las pautas MISEV201846. Todas las muestras se diluyeron al rango óptimo de partículas de trabajo antes de las mediciones utilizando 1 × PBS. Se grabaron cinco videos de 60 s de cada muestra con el nivel de la cámara establecido en 10. Se mantuvo una configuración de velocidad de flujo constante de 1000 durante la grabación. La temperatura fue monitoreada a lo largo de las mediciones. El instrumento se enjuagó con 1 × PBS entre mediciones. Los videos grabados para cada muestra se analizaron con el software NTA para determinar la concentración y la distribución del tamaño de las partículas medidas con el error estándar correspondiente. Se utilizó el mismo umbral de detección para el análisis.

El número de réplicas biológicas y las mediciones realizadas se aclaran en cada figura. Los errores estándar de todos los conjuntos de datos se calculan y trazan utilizando el software OriginPro y se verifican dos veces manualmente. Los datos se muestran como puntos de datos individuales y media ± SE.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen para gráficos y tablas se pueden encontrar en Datos complementarios asociados con este artículo. Los datos adicionales que contribuyeron a este estudio están presentes en la Información complementaria. Las imágenes de gel sin recortar y sin editar se incluyen en la figura complementaria S7. Todos los demás datos relacionados con este artículo pueden solicitarse a los autores correspondientes.

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Los autores agradecen el apoyo del Fondo Común de los NIH a través de la Oficina de Coordinación Estratégica/Oficina del Director de los NIH, 1UH3CA241684-01. CZ reconoce el apoyo de una beca del Consejo de Becas de China. RJC reconoce el apoyo de NCI R35 CA197570. Los autores agradecen el apoyo de la subvención Cancer Cure Venture (CCV), posible gracias a la Walther Cancer Foundation.

Estos autores contribuyeron por igual: Chenguang Zhang, Xiaoye Huo.

Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, EE. UU.

Chenguang Zhang, Xiaoye Huo, Satyajyoti Senapati y Hsueh-Chia Chang

Departamento de Biología, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, EE. UU.

Yini Zhu y Xin Lu

Departamento de Medicina, Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN, 37232, EE. UU.

James N. Higginbotham, Zheng Cao, Jeffrey L. Franklin, Kasey C. Vickers y Robert J. Coffey

Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Facultad de Medicina de la Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN, 37232, EE. UU.

Jeffrey L. Franklin y Robert J. Coffey

Aopia Biosciences, 31351 Medallion Dr, Hayward, CA, 94544, EE. UU.

Ceming Wang

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CZ, XH, CW y HCC concibieron la idea y diseñaron el estudio. CZ realizó las simulaciones de elementos finitos. CZ, XH, CW y ZC realizaron los experimentos. CZ analizó los resultados y escribió el manuscrito con aportes de todos los autores. YZ, LX, JNH, JLF, KCV y RJC proporcionaron muestras biológicas. CW, SS y HCC supervisaron el proyecto.

Correspondencia a Ceming Wang o Hsueh-Chia Chang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Shi Hu, Yuanjin Zhao y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Huan Bao y Gene Chong. Los informes de los revisores están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

Zhang, C., Huo, X., Zhu, Y. et al. Membrana nanoporosa magnética electrodepositada para inmunocaptura de vesículas extracelulares y lipoproteínas de alto rendimiento y alto rendimiento. Commun Biol 5, 1358 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04321-9

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Recibido: 12 mayo 2022

Aceptado: 30 de noviembre de 2022

Publicado: 10 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04321-9

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