Diversidad e interacciones de genes funcionales microbianos en diferentes condiciones ambientales: conocimientos de un biorreactor de membrana y una zanja de oxidación

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 18509 (2016) Citar este artículo

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El efecto de las condiciones ambientales sobre la diversidad y las interacciones de las comunidades microbianas ha causado un enorme interés en la ecología microbiana. Aquí, encontramos que con afluentes idénticos pero diferentes parámetros operativos (principalmente concentraciones de sólidos suspendidos en licor mixto (MLSS), tiempo de retención de sólidos (SRT) y concentraciones de oxígeno disuelto (OD), dos sistemas de tratamiento de aguas residuales municipales a gran escala que aplican zanjas de oxidación ( OD) y los procesos de biorreactor de membrana (MBR) albergaban la mayoría de los genes compartidos (87,2 %), pero tenían estructuras genéticas funcionales generales diferentes, como lo revelan dos conjuntos de datos de series temporales de 12 días generadas por una matriz de genes funcionales: GeoChip 4.2. Las redes de asociación de genes centrales del ciclo del carbono, nitrógeno y fósforo en cada sistema, basadas en la teoría de matriz aleatoria (RMT), mostraron diferentes propiedades topológicas y los nodos MBR mostraron una indicación de mayor conectividad. Se demostró que MLSS y DO son efectivos para dar forma a las estructuras genéticas funcionales de los sistemas mediante análisis estadísticos. Se pensó que concentraciones más altas de MLSS que resultaban en una menor disponibilidad de recursos del sistema MBR promovían interacciones positivas de genes funcionales importantes. Juntos, estos hallazgos muestran las diferencias de potencial funcional de algunos bioprocesos causados ​​por diferentes condiciones ambientales y sugieren que un mayor estrés por limitación de recursos aumentó las interacciones genéticas positivas en el sistema MBR.

Las plantas de tratamiento de aguas residuales (WWTP, por sus siglas en inglés) son las mayores aplicaciones de la ingeniería de bioprocesos utilizadas para el tratamiento de aguas residuales domésticas e industriales, y los consorcios microbianos desempeñan un papel central. Las funciones a nivel del sistema (p. ej., la biodegradación y mineralización de contaminantes orgánicos y el ciclo del nitrógeno y el fósforo) y la estabilidad del ecosistema se logran mediante el crecimiento, las actividades y las interacciones de poblaciones microbianas muy diversas. Como un ecosistema microbiano artificial único que está química y físicamente bien definido, las EDAR se consideran un campo de pruebas fértil para una serie de cuestiones ecológicas fundamentales1.

La heterogeneidad ambiental, definida como la variación espacial y temporal del ambiente físico, químico y biológico, es una propiedad fundamental de los ecosistemas2. Su papel en la configuración de la diversidad y composición de la comunidad microbiana es comúnmente valorado y un tema intrigante. Las plantas de tratamiento de aguas residuales están destinadas a proporcionar las condiciones ambientales adecuadas para mantener la abundancia de poblaciones microbianas, especialmente aquellos grupos funcionalmente importantes, dentro de los niveles normales para el rendimiento y la estabilidad del sistema. Por lo tanto, numerosos estudios se centran en la relación entre la diversidad de la comunidad microbiana y las condiciones ambientales basándose principalmente en genes 16S rRNA o genes funcionales específicos. Revelan las diferencias en la diversidad y composición microbiana resultantes de las diferenciaciones de, por ejemplo, las concentraciones de demanda química de oxígeno (COD inf)3, las concentraciones de oxígeno disuelto (OD)4 y el tiempo de retención sólido (SRT)5. Específicamente, se ha sugerido que los biorreactores de volumen fijo operados a SRT altos estarán altamente saturados con organismos que son capaces de utilizar eficientemente los recursos escasos ('estrategas K'), mientras que los SRT bajos ayudarán a enriquecer a los organismos de crecimiento rápido que son adaptado para una alta utilización de recursos ('estrategas r')6. Algunos estrategas K como Nitrospira sp., Nitrosomonas sp. y taxones filogenéticamente asociados con Planctomycetes y Chloroflexi, se demostró que estaban presentes solo en SRT ≥ 12 días en un sistema de tratamiento de aguas residuales donde se observaron diferentes SRT (30 d, 12 d y 3 d) y, correspondientemente, diferentes concentraciones de sólidos suspendidos en licor mixto (MLSS). aplicado en diferentes etapas5.

La descripción de la diversidad del inventario no es suficiente para obtener una imagen completa de la ecología microbiana de un ecosistema. Las interacciones microbianas también son un tema clave de la ecología microbiana, a través de las cuales diversas comunidades pueden desempeñarse mejor que las especies con mejor desempeño por sí solas. Con técnicas de alto rendimiento que disfrutan de una popularidad abrumadora y una gran cantidad de datos acumulados, las interacciones microbianas de los grupos taxonómicos que habitan en las EDAR se revelaron muy recientemente a través de sus patrones de co-ocurrencia espacial7 y temporal8. Es necesario aclarar el efecto de las variaciones ambientales en las interacciones microbianas para una comprensión sistemática de la ecología microbiana de las EDAR, lo que también puede permitir a los ingenieros estructurar dichas comunidades de manera más eficiente.

Actualmente, las EDAR municipales están diseñadas principalmente para conseguir la eliminación de carbono orgánico, nitrógeno y fósforo. Los biorreactores de membrana (MBR) y los biorreactores de lodos activados convencionales (CAS) (incluidos los sistemas que aplican procesos de lodos activados modificados, como el reactor por lotes secuencial (SBR), el anaeróbico-axoico-óxico (A2O) y la zanja de oxidación (OD)) se aplican comúnmente. procesos de tratamiento con diferentes parámetros operativos. Los MBR generalmente se operan a concentraciones más altas de MLSS, SRT más largos con filtración de membrana, concentraciones de OD más altas que resultan de una mayor intensidad de aireación para crear fuerzas de corte más altas para controlar el ensuciamiento de la membrana. Concentraciones más altas de MLSS que resultan en proporciones más bajas de alimentos a microorganismos (F/M) exponen a las comunidades MBR a un mayor estrés por nutrientes debido a la limitación de recursos. La diversidad microbiana y las interacciones de los MBR pueden ser diferentes de las de los biorreactores CAS. Además, aunque los sistemas MBR y CAS a gran escala para el tratamiento de aguas residuales municipales están destinados a apoyar a las poblaciones de crecimiento lento como los nitrificadores, ciertos estrategas K pueden tener ventajas en los MBR con SRT más largos. Diferentes concentraciones de DO también pueden causar diferencias específicas en la composición de las comunidades microbianas. La investigación sobre las diferencias de las poblaciones microbianas de los sistemas CAS y MBR debería ser una buena manera de comprender las correlaciones entre los gradientes ambientales y la ecología microbiana. Además, la caracterización de las comunidades microbianas presentes en los sistemas de ingeniería es valiosa para comprender la función del sistema.

Las investigaciones existentes arrojan luz sobre las diferenciaciones de estructuras taxonómicas9,10 y la diversidad de ciertos genes funcionales (p. ej., genes de nitrificación y desnitrificación) de los sistemas CAS y MBR11. Sin embargo, para abordar directamente los potenciales funcionales microbianos relacionados con los procesos del sistema, es crucial examinar más categorías de firmas funcionales microbianas, como los genes estructurales relevantes para las vías metabólicas, la energía y los circuitos reguladores12. Además de la diversidad microbiana, nunca se han informado las interacciones ecológicas de los microbios en los sistemas MBR, y mucho menos la interpretación de cómo las posibles interacciones microbianas de los ecosistemas difieren con los gradientes de disponibilidad de sustrato.

En este estudio, nos enfocamos en dos sistemas MBR y OD a gran escala operados en forma paralela en una planta de tratamiento de aguas residuales con afluentes idénticos. Según los datos emitidos por el Ministerio de Vivienda y Desarrollo Urbano-Rural de China, a finales de 2013, la tecnología OD había sido el proceso de tratamiento más utilizado en las plantas de tratamiento de aguas residuales (PTAR) municipales de China (representando el 26,7% en número). La capacidad de tratamiento acumulada de los sistemas OD ocupó el segundo lugar en China (con un 25,2 %), después de los sistemas A2O (con un 36,5 %). Las investigaciones de los dos sistemas de tratamiento son importantes para comprender no solo las correlaciones de los gradientes ambientales y la ecología microbiana, sino también el funcionamiento de la MWTP a gran escala. Para cada sistema, se recogieron 12 muestras diarias consecutivas y se analizó la diversidad de genes funcionales generales directamente relacionada con el potencial funcional microbiano de cada muestra mediante el uso de un microarreglo de genes funcionales completo: GeoChip 4.2. Las posibles interacciones de genes funcionales se revelaron a través de la construcción de redes de asociación mediante el uso de un algoritmo de teoría de matriz aleatoria (RMT)13. Las preguntas científicas específicas que abordamos son: (1) cuál es la diversidad de genes funcionales y la composición de los sistemas MBR y OD; (2) la importancia de los genes funcionales en cada sistema posiblemente vinculados; (3) cómo las variables ambientales afectan los patrones de ensamblaje temporal de los genes funcionales generales. Creemos que esto presenta una primera investigación que revela las diferenciaciones de la diversidad de genes funcionales y las posibles interacciones microbianas de los sistemas MBR y OD. También dará una idea útil del efecto de las condiciones ambientales en la ecología del mundo microbiano.

Los dos sistemas trataron aguas residuales municipales idénticas. Las diferencias de los procesos de tratamiento y las condiciones ambientales de los dos sistemas se muestran en la Tabla complementaria S1 en línea. Las concentraciones de COD inf fueron 399,4 ± 77,7 mg/L; las concentraciones de nitrógeno total afluente (TN inf) fueron 44,2 ± 5,9 mg/l; las concentraciones de amoníaco total entrante (NH4 + -N inf) fueron de 34,1 ± 5,4 mg/L y las concentraciones de fósforo total entrante (TP inf) fueron de 5,1 ± 1,3 mg/L (Tabla complementaria S2 en línea). Las concentraciones de pH, temperatura y OD del biorreactor del sistema MBR fueron 6,92 ± 0,07, 19,1 ± 0,7 °C y 2,95 ± 0,46 mg/L, respectivamente, y las de los sistemas OD fueron 7,05 ± 0,10, 19,3 ± 0,7 °C y 1,69 ± 0,51 mg/L, respectivamente (Tabla complementaria S3 en línea). La concentración de MLSS del sistema OD se mantuvo en torno a los 4.500 mg/L y la del sistema MBR en torno a los 7.000 mg/L. El SRT del sistema MBR fue de aproximadamente 20,5 d y el del sistema OD fue de aproximadamente 16,2 d. Los dos sistemas mostraron eficiencias de tratamiento relativamente estables. El sistema MBR mostró una mayor eficiencia de eliminación de DQO, mientras que el sistema OD tuvo un mejor rendimiento de eliminación de TN (Tabla complementaria S3 en línea).

Se detectaron un total de 36420 genes funcionales, con 35060 genes presentes en el sistema OD y 33117 genes presentes en el sistema MBR. Los genes estaban involucrados en 16 bioprocesos, como el ciclo del carbono, el ciclo del nitrógeno, el ciclo del fósforo y los fagos bacterianos. Los índices de diversidad α (Tabla 1) sugirieron que los dos sistemas tenían una alta diversidad de genes funcionales y el sistema OD exhibió una mayor diversidad microbiana. La mayoría de los genes funcionales (87,2%) fueron compartidos por los dos sistemas, involucrados en cada categoría. A pesar de los genes compartidos, cada sistema poseía unos genes únicos asociados en cada categoría. Los genes presentes solo en el sistema MBR representaron el 3,7% y el valor fue del 9,1% para el sistema OD.

Los dos sistemas mostraron distribuciones de abundancia relativa similares de cada categoría de genes funcionales. El sistema OD mostró abundancias relativas generales ligeramente superiores de los genes asociados con el fago bacteriano (p < 0,05, valor absoluto de d de Cohen = 0,89), ciclos de nitrógeno (p < 0,001, valor absoluto de d de Cohen = 1,31) y utilización de fósforo (p < 0,05, valor absoluto de la d de Cohen = 0,99) (fig. 1a).

Abundancias relativas de los genes funcionales implicados en determinados bioprocesos.

(a) cada categoría de genes funcionales, (b) cada subcategoría de genes del ciclo del carbono, (c) cada subcategoría de genes del ciclo del nitrógeno y (d) cada subcategoría de genes de utilización del fósforo. Las barras de error representan la desviación estándar de las abundancias relativas de cada categoría o subcategoría de genes en las 12 muestras del mismo sistema. Las diferencias significativas entre los sistemas indicadas por el análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas se indican mediante un asterisco encima de las barras, '*' (P < 0,05), '**' (P < 0,01), '***' (P < 0,001).

Para aclarar los detalles de las diferenciaciones potenciales funcionales de los dos sistemas, nos enfocamos en la diversidad de tres categorías importantes de genes funcionales: el ciclo del carbono, el ciclo del nitrógeno y la utilización del fósforo, ya que la eliminación de los contaminantes de carbono, nitrógeno y fósforo es la tarea principal de MWTP.

Se detectaron un total de 4129 genes asociados con el ciclo del carbono, con 3976 genes presentes en el sistema OD y 3735 genes presentes en el sistema MBR. Entre ellos, predominaron los genes de degradación del carbono, que representaron el 76,6%. Estos genes desempeñaron funciones en la eliminación de varios polisacáridos como el almidón, la celulosa y la quitina. Los genes de degradación de carbono fueron ligeramente más abundantes dentro del sistema MBR que en el sistema OD (p <0.05, d de Cohen = 0.95) (Fig. 1b).

Se detectaron un total de 2983 genes asociados con el ciclo del nitrógeno, que consisten en genes involucrados en amonificación (12,9%), nitrificación (14,2%), desnitrificación (43,4%), anammox (0,2%) y otros (29,3%). Los 424 genes de nitrificación detectados consistían en 408 genes amoA y 16 genes hao, de los cuales el 55,9 % procedían de supuestos nitrificantes heterótrofos como Pseudomonas putida. Además, el 11,3% de los genes de nitrificación eran del orden de los Nitrosomonadales, incluidos Nitrosomonas (siete genes), Nitrosospira (15 genes) y Nitrosovibrio (un gen), que son las bacterias oxidantes de amoníaco (AOB) comúnmente conocidas en las EDAR. Los genes de Nitrosospira tenían una abundancia relativa ligeramente mayor dentro del MBR (p < 0,05, valor absoluto de la d de Cohen = 0,88), con un cambio porcentual de abundancias relativas del 8,3 %. Además, se detectaron genes de arqueas, que representan el 18,4% de los genes de nitrificación. De los 1295 genes detectados asociados a la desnitrificación, el 88,5% procedían de aislados no cultivados. La abundancia relativa de genes de desnitrificación del sistema OD fue ligeramente mayor que la del sistema MBR (p <0.01, valor absoluto de d de Cohen = 1.09) (Fig. 1c).

Se detectaron un total de 528 genes asociados con la utilización de fósforo, incluidos genes ppk (37,3 %), genes ppx (57,6 %) y genes de fitasa (5,1 %). La polifosfato quinasa (ppk) es responsable de la síntesis de polifosfato (poliP) y los genes ppk no mostraron diferencias significativas en las abundancias relativas dentro de los dos sistemas (Fig. 1d). La exopolifosfatasa (ppx) es una enzima altamente procesada que cataliza el proceso de hidrólisis anaeróbica de residuos terminales de poliP de cadena larga a fosfato (Pi). Las abundancias relativas de genes ppx fueron significativamente más altas dentro del sistema OD que en el sistema MBR (p <0.001, valor absoluto de d de Cohen = 1.39) (Fig. 1d). La fitasa cataliza la liberación gradual de fosfato del fitato, la principal forma de almacenamiento de fósforo en las semillas de las plantas y el polen14. Los genes de fitasa tenían una abundancia relativa ligeramente mayor dentro del sistema MBR que en el sistema OD (p < 0,05, d de Cohen = 0,96) (Fig. 1d).

El resultado del escalamiento multidimensional no métrico (NMDS) reveló que las muestras de cada sistema se agruparon (Fig. 2). Además, las pruebas de disimilitud indicaron que los dos sistemas mostraron estructuras distintas de genes funcionales generales, genes de degradación del carbono, genes del ciclo del nitrógeno y genes del ciclo del fósforo (Tabla 2). La prueba de mantel no sugirió correlaciones significativas entre las eficiencias de eliminación de contaminantes (COD, TN y NH4 + -N) y las estructuras de genes funcionales generales. Dado que la eliminación de fósforo de los sistemas no se basó únicamente en procesos biológicos, las eficiencias de eliminación de fósforo no se relacionaron directamente con estructuras de genes funcionales al realizar el análisis.

Análisis de escalamiento multidimensional no métrico (NMDS) de los genes funcionales generales de las comunidades microbianas en las 24 muestras investigadas.

Las muestras del mismo sistema de tratamiento de aguas residuales agrupadas.

En cada sistema, las muestras no mostraron patrones obvios en el gráfico NMDS y las abundancias de cada categoría de genes funcionales tuvieron pequeñas variaciones durante los 12 días (Fig. 1), lo que indica que no hubo una sucesión diaria obvia de genes funcionales generales.

Se realizó un análisis de correspondencia canónica (CCA) para evaluar los efectos de nueve variables ambientales en las estructuras génicas funcionales generales, incluidas SRT, concentraciones de MLSS, concentraciones de OD, pH y temperatura de los biorreactores, concentraciones de COD inf, concentraciones de NH4 + -N inf, Concentraciones de TN inf y concentraciones de TP inf. SRT se evaluó como un factor redundante por su valor de factor de inflación de varianza (VIF) y, por lo tanto, se eliminó cuando había presencia de concentración de MLSS. Se generó un biplot de ordenación CCA de los genes funcionales generales y las variables ambientales restantes dispuestas a lo largo de los dos primeros ejes de ordenación al restringir los ejes para que fueran combinaciones lineales de puntuaciones de variables ambientales (Fig. 3). MLSS y DO se evaluaron como factores efectivos que dan forma a las estructuras genéticas funcionales generales de los dos sistemas en la trama CCA. El resultado de la prueba de la chimenea indicó vínculos significativos entre las estructuras genéticas funcionales generales y MLSS (r = 0,4281, P = 0,001), SRT (r = 0,4281, P = 0,001) y DO (r = 0,2795, P = 0,001). La prueba de chimenea no reveló correlaciones significativas entre las estructuras de genes funcionales y las características de las aguas residuales y la temperatura y el pH del biorreactor (datos no proporcionados).

Análisis de correspondencia canónica (CCA) de las intensidades de señal de genes funcionales generales y atributos ambientales.

El monto de la variación acumulada explicada para el eje 1 y el eje 2 fue de 43,3% y 12,0%, respectivamente.

Se notó la coexistencia de varios genes dentro de cada sistema. En el sistema OD, había un 50,9 % de genes presentes en todas las 12 muestras diarias. Para el sistema MBR el valor fue de 47,6%. La información detallada de los genes coexistentes en los 12 días de muestreo de cada sistema se muestra en la Tabla complementaria S4 en línea. Consideramos que estos genes coexistentes son los genes funcionales centrales de cada sistema. Las posibles interacciones de estos genes centrales implicados en el ciclo del carbono, el nitrógeno y el fósforo se revelaron mediante la construcción de redes basadas en un algoritmo RMT. En consecuencia, se obtuvo una red de 1.116 nodos y 1.741 enlaces (4,2% negativos y 95,8% positivos) para el sistema MBR y una red de 1.426 nodos y 1.462 enlaces (9,4% negativos y 90,6% positivos) para el sistema OD.

Las dos redes exhibieron características topológicas generales de las redes ecológicas, incluido el mundo pequeño y libre de escala y la modularidad (Texto complementario S1 en línea). Las estructuras topológicas de las dos redes diferían significativamente, incluida la distancia geodésica promedio, el coeficiente de agrupamiento promedio, la modularidad y la transitividad (Tabla 3). La conectividad promedio, el coeficiente de agrupamiento promedio y la transitividad de la red MBR fueron más altos que los de la red OD. Los enlaces entre los nodos cuya conectividad se clasificó entre los cinco primeros en cada red se muestran en la Fig. 4. Solo el 22,0% (458) de los nodos fueron compartidos por las dos redes. Se observaron diferencias significativas en la conectividad (p = 9,51 × 10−6) y los coeficientes de agrupamiento (p = 2,19 × 10−8) de estos nodos compartidos en las dos redes, como lo revelan las pruebas t pareadas.

Diferentes interacciones de red de genes funcionales clave en los dos sistemas.

( a ) Interacciones de red de los genes funcionales cuyas conectividades se clasificaron entre los cinco primeros en el sistema MBR. ( b ) Interacciones de red de los genes funcionales cuyas conectividades se clasificaron entre los cinco primeros en el sistema OD. Los colores de los nodos indican diferentes genes funcionales. Una línea azul indica una interacción positiva entre dos nodos y una línea roja indica una negativa. Los nodos en esta figura son genes relacionados con el ciclo del carbono, el ciclo del nitrógeno y la utilización del fósforo.

Se detectaron 200 módulos dentro de la red MBR y 295 módulos detectados en la red OD. En cada módulo se incluyeron varias categorías o subcategorías de genes funcionales. Para cada red, la mayoría de los nodos fueron evaluados como nodos periféricos, que casi siempre tienen pocos enlaces a los nodos dentro de sus módulos y representan especialistas desde una perspectiva ecológica. Pocos de los nodos se definieron como concentradores de módulos en cada sistema, que estaban altamente conectados a varios nodos en sus propios módulos. En la red MBR se detectaron 12 centros de módulos, que consisten en los genes involucrados en la degradación del carbono (66,7 %), la nitrificación (8,3 %), la desnitrificación (8,3 %), la fijación de nitrógeno (8,3 %) y la reducción de nitrógeno disimilar (8,3 %). En la red OD, se detectaron 16 nodos de módulos, que consisten en los genes relacionados con la degradación de carbono (37,5 %), la fijación de carbono (12,5 %), la utilización de fósforo (18,8 %), la desnitrificación (12,5 %), la fijación de nitrógeno (12,5 %). y reducción de N disimilitud (6,3%). Solo se detectó un conector (altamente vinculado a varios módulos) asociado con la amonificación de nitrógeno dentro de la red MBR y no se detectaron conectores dentro de la red OD. Desde una perspectiva ecológica, los hubs y conectores de módulos son generalistas. Ninguno de los concentradores o conectores de los módulos de las dos redes era igual. Los detalles de los concentradores y conectores del módulo de cada red se muestran en la Tabla complementaria S5 en línea.

Para cada red, se examinaron las relaciones entre la conectividad de los nodos y siete variables ambientales (OD, pH y temperatura de los biorreactores, COD inf, NH4 + -N inf, TN inf y TP inf). En la red OD, ninguno de los genes significativos (GS) de las variables ambientales mostró una correlación significativa con la conectividad del nodo. En la red MBR, el GS del pH del biorreactor mostró un vínculo débil con la conectividad del nodo (Tabla complementaria S6 en línea).

Se detectó una gran similitud de los genes funcionales generales de los dos sistemas. Se sabe que la eliminación de contaminantes orgánicos e inorgánicos transmitidos por aguas residuales (por ejemplo, PO43− y metales pesados) depende en gran medida de la coexistencia de varios grupos microbianos clave y de la presencia de especies microbianas particulares7,15. Los dos sistemas fueron diseñados para la eliminación de contaminantes orgánicos de carbono, nitrógeno y fósforo. Varios genes funcionales superpuestos pueden participar en cada bioproceso en ambos sistemas. Además, se utilizó lodo de inóculo del sistema OD para la puesta en marcha del sistema MBR. Las poblaciones originales de MBR procedían de la comunidad OD. Además, aguas residuales idénticas facilitarían la similitud de la comunidad, ya que las comunidades del biorreactor estaban exentas de las diferencias en la composición del sustrato y la comunidad fuente, en comparación con las poblaciones de los sistemas que reciben diferentes afluentes. Además, aguas residuales y ubicación idénticas llevaron a una temperatura y pH similares de los biorreactores, proporcionando a la comunidad condiciones físico-químicas similares. Se obtuvieron resultados similares en las plantas convencionales de remoción biológica mejorada de fósforo (EBPR) y MBR en Dinamarca, que mostraron una mayoría de genes 16S rRNA compartidos10.

Sin embargo, se mostraron ligeras diferencias en la abundancia de ciertas categorías y subcategorías de genes funcionales de los dos sistemas. Pueden resultar de las diferencias comunes en las condiciones ambientales de estos dos tipos de procesos de tratamiento. Se sugirió que los MBR tienen una mejor capacidad de desinfección que los sistemas CAS16. Se sugirió que la eliminación de fagos en un MBR se lograba en gran medida mediante la acumulación de biopelículas en la superficie de la membrana, lo que reducía físicamente el tamaño de los poros de la membrana, adsorbía químicamente los fagos y biológicamente permitía la depredación de fagos por parte de otros microorganismos17. Por lo tanto, los fagos bacterianos en el MLSS de los tanques de membrana (las muestras MBR) pueden ser de baja abundancia y pueden ser menos abundantes que los de las muestras OD. El SRT más largo del sistema MBR podría permitir el enriquecimiento de algunos microbios responsables de la degradación de compuestos de alto peso molecular como polisacáridos y proteínas18. Además, la mayor concentración de MLSS en el sistema MBR puede conducir a un aumento de la concentración de material coloidal, lo que presenta una nueva fuente de alimentación para los microorganismos capaces de capturar estos compuestos. Esto se verifica por el hecho de que las concentraciones de polisacáridos en el sobrenadante de los tanques de membrana del sistema MBR (2,4-6,5 mg/l) fueron superiores a las de los tanques de aireación del sistema OD (1,3-5 mg/l) durante abril de 2011 a marzo de 2012 (datos no publicados). Por lo tanto, los genes de degradación de carbono pueden ser más abundantes en las muestras de MBR. Las posibles razones de las diferencias en la abundancia de genes del ciclo del nitrógeno son las siguientes. La mayor abundancia de genes de nitrificación de Nitrosospira en el sistema MBR podría deberse a la menor relación F/M, ya que se sugirió que Nitrosospira se ve favorecida en concentraciones relativamente bajas de sustratos, en comparación con Nitrosomonas19. La mayor abundancia de genes de desnitrificación dentro del sistema OD podría deberse a la menor concentración de OD y la mayor relación F/M. El primero puede promover la desnitrificación y el segundo puede permitir que los desnitrificantes accedan a fuentes de carbono más fácilmente biodegradables. Las posibles explicaciones de las diferencias en la abundancia de genes de utilización de fósforo se enumeran a continuación. La mayor abundancia de genes ppx dentro del sistema OD puede deberse principalmente a la menor concentración de OD, lo que puede beneficiar el proceso de hidrólisis anaeróbica de los residuos terminales de pólipo de cadena larga a fosfato (Pi). Se sugirió que la fitasa no es necesaria para el crecimiento equilibrado de las células bacterianas, pero puede sintetizarse en respuesta a una limitación de nutrientes o energía20. La mayor abundancia de genes de fitasa del sistema MBR puede deberse a una situación más severa de limitación de nutrientes o energía a la que se enfrentaba la comunidad MBR. Estas diferenciaciones significativas en la abundancia de ciertos grupos de genes funcionales (por ejemplo, mayor abundancia de genes de degradación de carbono en el sistema MBR y mayor abundancia de genes de desnitrificación en el sistema OD) revelaron efectos específicos de gradientes ambientales en el potencial funcional de bioprocesos específicos. Pueden explicar las diferencias observadas en el rendimiento del sistema en la eliminación de COD y TN hasta cierto punto. También se revelaron estructuras diferentes de genes funcionales generales y categorías específicas de genes funcionales de los dos sistemas. Esto puede resultar de la existencia de genes únicos de cada sistema y de la abundancia de diferenciaciones de ciertos genes. Sin embargo, no se detectaron vínculos significativos entre el funcionamiento del sistema y las estructuras funcionales generales de los genes. Las posibles razones podrían ser que los genes funcionales únicos de cada sistema o los genes con diferentes abundancias pueden no estar tan estrechamente vinculados a las eliminaciones de COD, TN y NH4+ -N.

Además de las diferenciaciones de abundancias y estructuras de genes funcionales, la conectividad promedio más alta, el coeficiente de agrupamiento promedio, la transitividad y los porcentajes de interacción positiva de la red MBR sugirieron interacciones/acoplamientos más estrechos, especialmente interacciones positivas (facilitadoras) más estrechas dentro de la comunidad MBR. Esto puede deberse a las relaciones F/M más bajas de los sustratos de carbono, nitrógeno y fósforo en el sistema MBR. Para las poblaciones de la RBM, la mejora del estrés de la escasez de sustrato mediante colaboraciones con los vecinos puede ser una buena opción. Por ejemplo, los grupos de degradación de carbono podrían aumentar la disponibilidad de carbono orgánico fácilmente degradable para desnitrificantes. Por lo tanto, la población de degradación de carbono orgánico y los desnitrificadores pueden estar más estrechamente conectados en el sistema MBR que en el sistema OD. De manera similar, se podría esperar que la facilitación sea el resultado neto dominante a niveles moderados de estrés impulsado por los recursos en las plantas21 y se observó que las interacciones positivas entre las especies de plantas eran dominantes a niveles moderados de estrés por lluvia22. No se detectaron superposiciones de los nodos generalistas dentro de las dos redes, lo que indica que diferentes nodos (genes) desempeñaron funciones importantes dentro o entre los módulos de los sistemas MBR y OD.

El CCA reveló que MLSS y DO fueron los factores principales que dieron forma a las estructuras genéticas funcionales de los dos sistemas, lo cual se verificó mediante la prueba de chimenea. Como se discutió anteriormente, el MLSS más alto del sistema MBR, que resultó en relaciones F / M más bajas, puede favorecer a los estrategas K como Nitrosospira, seleccionar contra los desnitrificantes y promover los genes de fitasa en el sistema MBR. Además, resultó en más polisacáridos del sobrenadante, lo que puede contribuir a la mayor abundancia de genes de degradación de carbono del sistema MBR. Las tasas de aireación más altas del sistema MBR pueden seleccionar contra los desnitrificadores y los genes ppx. Debido a la correlación numérica entre las concentraciones de SRT y MLSS al realizar el CCA, SRT no se evaluó como una variable redundante en presencia de MLSS y se excluyó del gráfico CCA. Por otro lado, la correlación significativa entre SRT y las estructuras de genes funcionales en la prueba de chimenea indica que SRT puede ejercer algunos efectos sobre las estructuras de genes funcionales. Específicamente, como se discutió anteriormente, el SRT más largo del sistema MBR podría ayudar a promover algunos organismos capaces de degradar polisacáridos, por ejemplo, Chloroflexi5,23. Puede ser una explicación de la mayor abundancia de genes de degradación del carbono. Se demostró que los SRT cortos tienen impactos en las comunidades microbianas de las plantas de tratamiento de aguas residuales en investigaciones anteriores. Se indicó que un sistema operado en un SRT de 3d no albergaba Nitrospira sp. y Nitrosomonas sp.5. Otro sistema operado con SRT de 10 d, 3 d y 5 d demostró tener poblaciones microbianas más diversas cuando tenía un SRT más alto24. Sin embargo, las diferentes SRT de los dos sistemas no dieron lugar a diferencias significativas en la abundancia de genes de nitrificación (Fig. 1c). La posible razón podría ser que los SRT de los dos sistemas (20,5 d y 16,2 d) podrían permitir que prosperaran los nitrificadores. Además de los efectos de los parámetros operativos en las estructuras de genes funcionales, un bajo porcentaje de nodos compartidos, diferentes estructuras topológicas y diferentes roles topológicos de los nodos en las dos redes indicaron que las diferenciaciones de parámetros operativos también alteraron las posibles interacciones microbianas de los dos sistemas. El mayor MLSS del sistema MBR aumentó el estrés por limitación de recursos y, por lo tanto, puede aumentar las interacciones positivas entre los genes funcionales asociados con el ciclo del carbono, nitrógeno y fósforo. Los posibles impactos de los procesos de tratamiento y las variables ambientales en la diversidad y las interacciones de los genes funcionales en los dos sistemas se resumen en la Tabla complementaria S1 en línea.

Las características de las aguas residuales y la temperatura y el pH del biorreactor, que eran vulnerables a las variaciones de los afluentes, desempeñaron un papel relativamente pequeño en la configuración de las estructuras genéticas funcionales generales. Además, ninguno de los vínculos significativos o débiles entre estas variables y la topología de cada red revelaron su incapacidad para afectar las posibles interacciones microbianas. La razón podría ser que los dos sistemas tenían pequeñas fluctuaciones en las características de las aguas residuales y temperatura y pH básicamente estables durante los días de muestreo. Además, algunas variables influyentes no medidas también podrían contribuir a cambios significativos en la diversidad de genes funcionales y afectar las posibles interacciones de los genes funcionales centrales en cada sistema.

Cuando se implementa el muestreo a largo plazo, se cubren gradientes más grandes en otros parámetros, por ejemplo, la temperatura y el pH del biorreactor. Las principales variables ambientales que afectan la ecología microbiana pueden ser diferentes. Una investigación a largo plazo en una única planta de tratamiento de aguas residuales que utilizó secuenciación de alto rendimiento indicó la importancia de la temperatura y la salinidad en la conducción de la dinámica estacional de los géneros con abundancias significativamente cambiadas durante un período de más de 4 años25. Otro estudio indicó la falta de fuertes correlaciones entre los factores ambientales y varias unidades de taxonomía operativa (OTU) persistentes en una planta de tratamiento de aguas residuales. Las condiciones ambientales (principalmente SRT y nitrógeno inorgánico) explicaron parcialmente las variaciones filogenéticas e influyeron indirectamente en el ensamblaje bacteriano8. Estos estudios sugieren que las variables efectivas que dan forma a las estructuras de la comunidad microbiana pueden ser específicas de cada caso. Sin embargo, se han informado pocas investigaciones a largo plazo sobre las comunidades de MBR y sistemas de lodos activados. Tal investigación tampoco discutió qué variables eran predominantes para conducir a las diferenciaciones observadas de la diversidad microbiana11. Se sugiere realizar un muestreo de series de tiempo prolongado (por ejemplo, mensual, estacional y anual) de las comunidades en MBR y sistemas de lodos activados mediante estudios adicionales para permitir discusiones profundas sobre la correlación entre la ecología microbiana y los gradientes ambientales, con grandes gradientes ambientales. tanto en parámetros físico-químicos como operativos cubiertos.

En resumen, en este estudio mostramos que las diferencias en los parámetros operativos (MLSS, SRT y DO) de dos sistemas MBR y OD operados en paralelo afectaron no solo los potenciales funcionales de ciertos bioprocesos sino también las interacciones microbianas. Estos resultados dan una idea útil del efecto de las diferentes condiciones ambientales en la ecología microbiana. Las EDAR son sistemas ecológicos microbianos bien controlados, pero solo conocemos la punta del iceberg de ellos. Estudios adicionales sobre estos sistemas que tengan como objetivo responder preguntas ecológicas clave y comprender los sistemas para un mejor diseño y operación de los mismos son de gran importancia.

Las dos instalaciones de tratamiento de aguas residuales a gran escala están ubicadas en una planta de tratamiento de aguas residuales en Wuxi, provincia china de Jiangsu. Uno de ellos es un OD orbal y el otro es un MBR acoplado con un proceso anaeróbico-anóxico-óxico (A2O-MBR). Tratan aguas residuales idénticas (domésticas: industriales = 0,6: 0,4) a la misma escala (50 000 m3/d) y el lodo MBR se inoculó originalmente con el lodo OD. La remoción de carbono orgánico y nitrógeno contaminantes de los sistemas se logró a través de procesos biológicos y la remoción de fósforo de los mismos fue tanto a través de procesos biológicos como de precipitación química. Habían sido operados con buena eficiencia de tratamiento y estabilidad al menos durante un año y tres meses antes del muestreo26,27.

Se tomaron muestras de MLSS de las zonas aeróbicas del sistema OD y de los tanques de membrana del sistema A2O-MBR una vez al día durante 12 días consecutivos del 10 al 21 de abril de 2011. Cada día, se recolectaron 50 ml de MLSS en cada sitio. Cada muestra se dispensó en un tubo Eppendorf estéril de 50 ml y se centrifugó a 14 000 g durante 10 min. Los sedimentos se almacenaron a -80 °C para su análisis. Se realizaron mediciones diarias para decidir las concentraciones de contaminantes de muestras compuestas de 24 h de afluentes y efluentes y temperaturas, pH y concentraciones de OD de las zonas de aireación de cada sistema. Los valores aproximados de las concentraciones de MLSS y SRT fueron proporcionados por el personal de planta.

El ADN genómico microbiano se extrajo de los gránulos de muestras de lodo activado mediante una combinación de congelación y dodecilsulfato de sodio (SDS) para la lisis celular como se describió anteriormente28. A continuación, los productos extraídos se purificaron empleando el kit de purificación de ADN genómico Wizard® SV (Promega, Madison WI).

1 μg de ADN se marcó, purificó y secó como se describió previamente29. Todo el ADN marcado se resuspendió en 10 μL de solución de hibridación como se describió previamente30 y se hibridó con GeoChip 4.2 en una estación de hibridación MAUI (BioMicro, Salt Lake City, UT, EE. UU.) a 42 °C con formamida al 40 % durante 16 h. Los microarrays se escanearon con un sistema de análisis de microarrays ScanArray 5000 (PerkinElmer, Wellesley, MA, EE. UU.) al 100 % de la potencia del láser.

Las intensidades de señal de las manchas se midieron con ImaGene 6.0 (Biodiscovery Inc., El Segundo, CA, EE. UU.). El pretratamiento de datos se realizó en línea (ieg.ou.edu). Los porcentajes de sondas termófilas (controles negativos) en cada muestra se hicieron inferiores al 5% mediante la eliminación de manchas de baja calidad. Los genes detectados solo en tres o menos muestras de 12 muestras del mismo sistema se eliminaron para evitar posibles ruidos. Para cada muestra, las intensidades de los genes se transformaron luego a la forma logarítmica natural y se dividieron por la intensidad media de la señal.

La información detallada de los genes detectados y sus intensidades de señal está disponible en Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, número de acceso GSE 67307).

Para revelar las diferencias de las comunidades microbianas, se realizaron tres pruebas estadísticas multivariadas no paramétricas que incluyen análisis de varianza multivariante no paramétrico (ADONIS), análisis de similitud (ANOSIM) y procedimiento de permutación de respuesta múltiple (MRPP) y un análisis NMDS. Para probar si los índices de diversidad y las abundancias de cada categoría funcional de genes y ciertas subcategorías o grupos filogenéticos en los dos sistemas diferían, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas. Se aplicó la d de Cohen para evaluar la magnitud de los efectos del tratamiento y una regla convencional es considerar una d de Cohen de 0,8 como grande, lo que sugiere que el 79 % del grupo de control tendría una puntuación inferior a la del grupo experimental31,32. Para evaluar los efectos de los factores ambientales en las estructuras funcionales generales de la comunidad, se realizaron un CCA y una prueba de chimenea. En CCA, el VIF para cada atributo ambiental se utilizó para identificar la multicolinealidad entre las variables explicativas. El factor con un valor de VIF superior a 20 se consideró una restricción redundante y se eliminó. Todos los análisis estadísticos anteriores se realizaron con código R (http://www.r-project.org/).

Para desvelar las posibles interacciones microbianas de los genes asociados con el ciclo del carbono, el nitrógeno y el fósforo, se construyeron dos redes de asociación microbiana basadas en RMT utilizando una tubería de análisis de redes ecológicas moleculares integral (MENAP) (http://ieg2.ou.edu/MENA/ )13. Se aplicó una matriz de similitud de "correlación de Pearson en series de tiempo (permite un retraso de 1 punto de tiempo)". Para cada sistema, solo los genes detectados en todas las muestras de 12 semanas (regla de la mayoría) se mantuvieron para la construcción de la red. Este paso de filtrado eliminó genes funcionales pobremente representados y redujo la complejidad de la red33. Para cada red, se generaron 100 redes aleatorias correspondientes, con el mismo tamaño de red y número promedio de enlaces. La prueba Z se utilizó para probar las diferencias de los índices entre las redes construidas y las redes aleatorias. Para caracterizar la propiedad de modularidad, cada red se separó en módulos mediante la optimización de modularidad rápida y codiciosa. Los roles topológicos de los diferentes nodos se dividieron en las siguientes cuatro subcategorías por conectividad dentro del módulo (zi) y entre conectividad del módulo (Pi): (i) nodos periféricos; (ii) conectores; (iii) concentradores de módulos; y (iv) centros de red34. Para la comparación entre los índices de red de diferentes sistemas, se empleó la prueba t de Student usando las desviaciones estándar derivadas de las redes aleatorias correspondientes. Se realizó una prueba t pareada para hacer comparaciones entre las estructuras topológicas de los nodos compartidos de las dos redes. Las relaciones entre la topología de la red microbiana y las características ambientales se examinaron de forma indirecta midiendo la correlación entre el GS y la conectividad de los nodos12. Cytoscape_3.2.1 se utilizó para la visualización de la red de los nodos, cuya conectividad se clasificó entre los cinco primeros.

Cómo citar este artículo: Xia, Y. et al. Diversidad e interacciones de genes funcionales microbianos en diferentes condiciones ambientales: conocimientos de un biorreactor de membrana y una zanja de oxidación. ciencia Rep. 6, 18509; doi: 10.1038/srep18509 (2016).

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Agradecemos al Dr. Wolfgang Sand de la Universidad de Duisburg-Essen por mejorar la escritura en inglés del manuscrito final. Este estudio fue apoyado por la NSFC (51178239) y el fondo especial del State Key Joint Laboratory of Environmental Simulation and Pollution Control (14L03ESPC).

Laboratorio Conjunto Clave Estatal de Simulación Ambiental y Control de la Contaminación, Escuela de Medio Ambiente, Universidad de Tsinghua, 100084, Beijing, República Popular China

Yu Xia, Man Hu, Xianghua Wen, Xiaohui Wang, Yunfeng Yang y Jizhong Zhou

Instituto de Genómica Ambiental y Departamento de Botánica y Microbiología, Universidad de Oklahoma, OK, Norman, EE. UU.

Jizhong Zhou

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YX hizo un análisis estadístico de los datos de GeoChip y escribió el borrador del manuscrito. MH hizo extracción de ADN y pretratamiento de datos. Xianghua Wen fue uno de los diseñadores del experimento, supervisó el análisis de datos y revisó el manuscrito. Xiaohui Wang realizó el muestreo, la medición de datos ambientales y la hibridación de GeoChip. YFY dio algunas sugerencias para el análisis de datos y la revisión del manuscrito. JZZ ayudó a diseñar los experimentos y proporcionó la herramienta GeoChip 4.2.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Xia, Y., Hu, M., Wen, X. et al. Diversidad e interacciones de genes funcionales microbianos en diferentes condiciones ambientales: conocimientos de un biorreactor de membrana y una zanja de oxidación. Informe científico 6, 18509 (2016). https://doi.org/10.1038/srep18509

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Recibido: 26 Agosto 2015

Aceptado: 19 de noviembre de 2015

Publicado: 08 enero 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18509

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