Efecto antibiopelícula potenciado por la modificación de 1,2,3

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 24289 (2016) Citar este artículo

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La bioincrustación impide el rendimiento de los biorreactores de membrana. En este estudio, investigamos los efectos antiincrustantes de las membranas de polisulfona modificadas con nanopartículas de 1,2,3-triazol y paladio (Pd). Se evaluó la eficacia antibacteriana y antiincrustante de las membranas modificadas en un biofilm de especies de monocultivo (es decir, reactor de biofilm de flujo por goteo, DFR) y un experimento de biofilm de especies mixtas (es decir, reactor de membrana aeróbica, AeMBR). Las nanopartículas de 1,2,3-triazol y Pd inhibieron el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. La disminución en el crecimiento bacteriano se observó junto con una disminución en la cantidad de polisacáridos totales dentro de la matriz de biopelícula de especies de monocultivo. Cuando las membranas modificadas se conectaron a AeMBR, el aumento de la presión transmembrana fue menor que el de las membranas no modificadas. Esto fue acompañado por una disminución en las concentraciones de proteínas y polisacáridos dentro de la matriz de biopelícula de especies mixtas. La cantidad de biomasa en la capa de biopelícula también fue menor en presencia de membranas modificadas y no hubo ningún efecto perjudicial sobre el rendimiento del reactor evaluado a partir de las tasas de eliminación de nutrientes. El análisis de 16S rRNA atribuyó además el retraso en el ensuciamiento de la membrana a la disminución de la abundancia relativa de grupos bacterianos seleccionados. Estas observaciones apuntan colectivamente a una menor incidencia de incrustaciones lograda por las membranas modificadas.

Los biorreactores de membrana (MBR) se utilizan cada vez más como una biotecnología preferida para el tratamiento de aguas residuales porque el acoplamiento de un proceso de separación por membrana lograría una mejor calidad del efluente. Las membranas también se pueden usar para retener metales catalíticos (p. ej., óxido de manganeso, paladio) dentro de los biorreactores. Los metales catalíticos, a su vez, logran la hidrodeshalogenación reductora de contaminantes (p. ej., productos farmacéuticos y de cuidado personal, biocidas y microcontaminantes orgánicos) que, de otro modo, no se biodegradarían fácilmente en un proceso convencional de lodos activados. Para demostrarlo, se ha utilizado paladio (Pd) como metal catalítico para lograr la eliminación reductora de productos farmacéuticos, biocidas y medios de contraste yodados1. De manera similar, se usó Pd en un reactor de membrana de placa continua para lograr una eliminación completa, eficiente y rápida de tricloroeteno (TCE)2. En ambos casos, el Pd se retuvo físicamente en el MBR mediante el uso de membranas de nanofiltración de fibra hueca o se recirculó por todo el sistema del reactor en forma de suspensión. Sin embargo, la falta de un material de soporte para estas nanopartículas puede resultar en la aglomeración y crecimiento de las nanopartículas, lo que provocará una disminución posterior del efecto catalítico3,4.

Alternativamente, las partículas de Pd se pueden incrustar en las superficies de la membrana para lograr una distribución uniforme de este catalizador en toda el área de la superficie reactiva. Por ejemplo, Hennebel y colaboradores encapsularon partículas de Pd en membranas de fluoruro de polivinilideno y demostraron que tales contactores de membrana modificados pueden usarse en el tratamiento de agua contaminada con diatrizoato5. Sin embargo, existe la posibilidad de que las membranas que contienen Pd sean susceptibles a la deposición de bioincrustantes durante el transcurso de la operación del reactor. Esto se debe a que, a diferencia de algunos metales pesados ​​como las nanopartículas de plata o cobre que muestran fuertes efectos antibacterianos6,7,8,9, las nanopartículas de Pd solo tienen efectos antibacterianos débiles y selectivos10. La bioincrustación es especialmente perjudicial para el rendimiento de los biorreactores de membrana, ya que puede provocar una menor producción de permeado, un aumento de la presión transmembrana y una vida útil más corta del módulo de membrana11. Además, los bioincrustantes como las proteínas y los polisacáridos pueden envenenar la superficie del catalizador y provocar una baja actividad catalítica.

Una estrategia para superar esta limitación sería incorporar grupos químicos funcionalmente activos en las membranas encapsuladas con Pd. Un ejemplo de dicho grupo químico funcionalmente activo son los ligandos de triazol. Se ha descubierto que los ligandos de triazol exhiben efectos citotóxicos en las células cancerosas12. También puede interactuar con el citocromo P450 que, a su vez, inhibe la biosíntesis de ergosterol en los hongos. El resultado final es un impacto perjudicial en las actividades enzimáticas unidas a la membrana y la permeabilidad de la membrana para las células fúngicas13,14. Además, los ligandos de triazol mostraron efectos antibacterianos al inhibir la biosíntesis del alcohol isoprenoide C-55 y la vitamina K. La deficiencia de alcohol isoprenoide C-55 afectaría a su vez la biosíntesis de la pared celular bacteriana y el polímero de la membrana; y la falta de vitamina K tendría un impacto perjudicial en el transporte de electrones de las bacterias grampositivas15.

Hasta la fecha, existen estudios limitados para demostrar el uso de ligandos de triazol como agente antiincrustante en membranas poliméricas. Un estudio anterior había demostrado que el polímero que contenía triazol tenía un efecto inhibidor sobre el número de células de Pseudomonas aeruginosa suspendidas y adheridas recuperadas de una membrana polimérica16. Aunque se infiere que un efecto antibacteriano se relacionaría con un retraso en la aparición del ensuciamiento de la membrana, el estudio no demostró el uso de membranas antibacterianas en un biorreactor de membrana operativo para lograr el ensuciamiento retardado de la membrana. El estudio tampoco evaluó cómo los ligandos de triazol logran un efecto antiincrustante cuando se funcionalizan en membranas, o si se puede lograr un efecto antiincrustante sinérgico en presencia de triazol y Pd.

En este estudio, proponemos la incrustación de Pd en la membrana de PSU funcionalizada con 1,2,3-triazol para minimizar el ensuciamiento de la membrana tanto en el monocultivo bacteriano como en experimentos complejos de biopelículas. El estudio primero evalúa diferentes concentraciones de triazol, a saber, 23 %, 49 % y 94 %, que se funcionalizaron en las membranas. Estas membranas se denominan posteriormente PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 % y PSU-TriN-94 %. En segundo lugar, se incrustaron iones de paladio o nanopartículas de paladio en membranas de PSU funcionalizadas con triazol al 94 % (es decir, PSU-TriN-Ions o PSU-TriN-NP, respectivamente). Se examinaron los impactos que estas membranas modificadas tenían sobre las proteínas, las concentraciones de polisacáridos y sobre el número de células bacterianas intactas en la matriz de biopelícula adherida y se compararon con el control respectivo. Además, el cambio en el nivel de bioactividad como resultado de la perturbación de la comunidad microbiana se caracterizó mediante la secuenciación de próxima generación de amplicón basada en el gen 16S rRNA. Este estudio tiene como objetivo demostrar que una membrana de PSU modificada con triazol y Pd mostraría altas propiedades antiincrustantes y proporcionar un enfoque multifacético para estudiar cómo se produciría el retraso en el ensuciamiento de la membrana para dichas membranas modificadas.

La modificación con triazol de las membranas de PSU aumentó la hidrofilicidad de las membranas de PSU excepto cuando PSU-TriN-94% se quelaron con los iones Pd (Tabla 1). La membrana PSU-TriN-NPs mostró la mayor hidrofilia (47,7°) en comparación con todas las demás membranas probadas, que oscilaron entre 58,6° y 84,3°. Entre todas las membranas probadas, la membrana PSU-TriN-NPs tenía la topografía superficial más rugosa (Ra = 58,9). Tanto las membranas PSU-TriN-Ions como PSU-TriN-NPs tenían promedios aritméticos de rugosidad (Ra) tres veces más altos que las membranas PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 %, PSU-TriN-94 % y hasta Rugosidad de la superficie 9 veces mayor que la membrana PSU-Tri-0% (Tabla 1, Figura S1).

La relación vivo/muerto de microorganismos fuertemente unidos en la matriz de biopelícula de PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 % y PSU-TriN-94 % se examinó con un microscopio confocal (Figura S2) . La relación vivo/muerto de la matriz de biopelícula en PSU-TriN-0% fue superior a 1 tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Por el contrario, la proporción de PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 %, PSU-TriN-94 % fue inferior a 1 y, respectivamente, se encontró que era significativamente menor que PSU-TriN-0 %, que era 1,24 en aeróbico y 1,36 en condiciones anaeróbicas (prueba t, P <0,01) (Fig. 1A, B). De manera similar, el número de células intactas en la matriz de biopelícula de PSU-TriN-0% se enumeró mediante citometría de flujo y se encontró que era significativamente mayor en comparación con las membranas de PSU funcionalizadas con triazol en condiciones aeróbicas y anaeróbicas (prueba t, todo P <0.05) (Figura S3A,B). Específicamente, las células vivas en la biopelícula de las membranas de PSU (PSU-TriN-0%) fueron aproximadamente 5 veces más altas en condiciones aeróbicas y aproximadamente 8 veces más altas en condiciones anaeróbicas en comparación con las tres membranas restantes. Además, la biopelícula estrechamente unida, que se representa como la diferencia entre la biopelícula total y la biopelícula débilmente unida (Figura S3A,B) tenía hasta 1,8 × 107 células/(mL · cm2) y 3,95 × 108 células/(mL · cm2) en PSU-TriN-0% tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, respectivamente. El número de células intactas fue mayor que el observado en las membranas PSU-TriN-23%, PSU-TriN-49% y PSU-TriN-94%.

Proporción viva/muerta de bacterias adheridas a diferentes membranas.

(A) Se probaron diferentes concentraciones de membranas de triazol polisulfona en condiciones aeróbicas. (B) Cuatro concentraciones diferentes de membrana de triazol polisulfona en condiciones anaeróbicas. (C) Las membranas PSU-TriN-94%, PSU-TriN-Ions y PSU-TriN-NPs se cuantificaron en condiciones aeróbicas. (D) Membranas PSU-TriN-94%, PSU-TriN-Ions y PSU-TriN-NPs en condiciones anaeróbicas.

La relación vivo/muerto en PSU-TriN-NP fue de 0,26 en condiciones aeróbicas y de 0,52 en condiciones anaeróbicas, lo que indica que la presencia de nanopartículas de Pd puede disminuir significativamente la relación vivo/muerto en condiciones aeróbicas (prueba t, P = 0,00) y anaeróbicas ( prueba t, P = 0,03) en comparación con PSU-TriN-94% (proporción de 0,77 y 0,86, en condiciones aeróbicas y anaeróbicas, respectivamente) (Fig. 1C, D). La membrana PSU-TriN-Ions también podría reducir aún más la relación vivo/muerto a 0,43 y 0,48 en condiciones aeróbicas y anaeróbicas, respectivamente, en comparación con la membrana PSU-TriN-94 % (prueba t, P < 0,05) (Fig. 1C,D).

Tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, P. aeruginosa PAO1 produjo 2,34 ± 0,20 μg/(mL · cm2) de polisacáridos totales en condiciones aeróbicas y 3,25 ± 0,26 μg/(mL · cm2) en condiciones anaeróbicas dentro de su matriz de biopelícula en PSU-TriN- 0% membranas. La cantidad de polisacárido en PSU-TriN-0% para ambas condiciones fue significativamente mayor que la de las membranas modificadas con triazol. (es decir, PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 %, PSU-TriN-94 %) (prueba t, todo P < 0,03) (Fig. 2A,B). También se pudo obtener una diferencia significativa entre las membranas PSU-TriN-94% y PSU-TriN-NPs (Fig. 2C, D, prueba t, P = 0.01 y 0.02, respectivamente, en condiciones aeróbicas y anaeróbicas). Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre las membranas PSU-TriN-94 % y PSU-TriN-Ions (prueba t, P = 0,12 y 0,13, respectivamente, en condiciones aeróbicas y anaeróbicas). Específicamente, la menor producción de polisacáridos en el biofilm de monocultivo se debió a la concentración significativamente menor de exopolisacáridos (incluidos Pel, Psl y polisacáridos de alginato) producidos por P. aeruginosa PAO117 en las tres membranas modificadas con triazol que las membranas PSU-TriN-0% en condiciones tanto aeróbicas (prueba t, P < 0,03) como anaeróbicas (prueba t, P < 0,02) (Figura S4A,B). Se observó una reducción adicional significativa en los exopolisacáridos para PSU-TriN-NP pero no para PSU-TriN-Ions en comparación con PSU-TriN-94% tanto en aeróbicos (prueba t, P = 0.00 y 0.07, respectivamente) como anaeróbicos ( Prueba t, P = 0,01 y 0,84, respectivamente) (Figura S4C,D).

Cuantificación de polisacáridos totales en la biopelícula adherida a (A) diferentes concentraciones de membranas de triazol en condiciones aeróbicas, (B) diferentes concentraciones de membranas de triazol en condiciones anaeróbicas, (C) PSU-TriN-94%, PSU-TriN-Ions y PSU -TriN-NPs en condición aeróbica, (D) PSU-TriN-94%, PSU-TriN-Ions y PSU-TriN-NPs en condición anaeróbica.

En contraste, las membranas modificadas con triazol solo redujeron significativamente la producción de proteínas de Pseudomonas aeruginosa PAO1 en condiciones anaeróbicas (prueba t, todos los P < 0.05) pero no mostraron ninguna reducción significativa de proteínas en condiciones aeróbicas (Fig. 3A, B ). Una comparación adicional de las membranas PSU-TriN-94% con las membranas PSU-TriN-Ions y PSU-TriN-NPs tampoco mostró diferencias significativas para la expresión de proteínas en condiciones aeróbicas y anaeróbicas (Fig. 3C, D).

Proteínas en biopelícula establecidas en PSU-TriN-0%, PSU-TriN-23%, PSU-TriN-49% y PSU-TriN-94% en condiciones (A) aeróbicas y (B) anaeróbicas. Proteínas en biopelícula establecidas en PSU-TriN-94%, PSU-TriN-Ions y PSU-TriN-NP en (C) condiciones aeróbicas y (D) anaeróbicas.

PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-94 % y PSU-TriN-NP se evaluaron más en cuanto a su efecto antiincrustante conectándolos a un biorreactor de membrana aeróbica a escala de laboratorio (AeMBR) para establecer un consorcio de biopelícula mixta. En ambas corridas, PSU-TriN-NPs mostraron un TMP más bajo en el punto de recolección. Para ilustrar, las membranas PSU-TriN-0 % y PSU-TriN-94 % alcanzaron un ensuciamiento crítico en los días 29 y 28 de operación en el ciclo 1, respectivamente, pero no las PSU-TriN-NP (Figura S5A). En la ejecución 2, las PSU-TriN-NP solo alcanzaron 10 kPa en su TMP, que fue inferior a las dos membranas restantes cuando la PSU-TriN-0 % alcanzó un ensuciamiento crítico el día 21 (Figura S5B). Las tres membranas lograron una eficiencia de eliminación de la demanda química de oxígeno (DQO) promedio del 95 % tanto en el ciclo 1 como en el ciclo 2.

La concentración de polisacárido en el EPS soluble del biofilm adherido a PSU-TriN-NP fue de 48,1 ± 10,7 μg/cm2. Esta concentración fue significativamente menor que la cantidad en las membranas PSU-TriN-0 % (59,0 ± 5,4 μg/cm2) y PSU-TriN-94 % (102,3 ± 29,0 μg/cm2) en el ciclo 1 (prueba t, P = 0,05 y 0,00, respectivamente). En el ensayo 2, la concentración de polisacárido en PSU-TriN-0 % fue de 40,7 ± 12,0 μg/cm2. Por el contrario, hubo una disminución significativa a 5,86 ± 0,48 μg/cm2 de polisacárido en PSU-TriN-NP (prueba t, P = 0,00) (Fig. 4A, B). Además, la cuantificación de polisacárido en las corrientes de retenido y permeado de AeMBR mostró que la cantidad de polisacárido retenido (11,4 μg/mL en el ciclo 1 y 8,0 μg/mL en el ciclo 2) fue mayor que la del permeado (6,5 μg/mL, 6,5 μg/ mL, 5,6 μg/mL en el experimento 1 y 5,9 μg/mL, 2,7 μg/mL, 5,2 μg/mL en el experimento 2, respectivamente, de PSU-TriN-0%, PSU-TriN-94%, PSU-TriN-NPs ), lo que indica el rechazo de algunos polisacáridos por las membranas (Figura S6A,B).

Cuantificación de polisacáridos y proteínas en la sustancia polimérica extracelular (EPS) soluble adherida a PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-94 % y PSU-TriN-NP de la ejecución 1 y la ejecución 2. (A) Polisacárido en la ejecución 1, (B ) Polisacárido en la ejecución 2, (C) Proteína en la ejecución 1, (D) Proteína en la ejecución 2.

La concentración de proteína unida a la membrana PSU-TriN-NPs fue de 34,14 μg/cm2 en el ciclo 1 y fue significativamente menor que las otras dos membranas (prueba t, P = 0,00 y 0,00) (Fig. 4C). Se pudo obtener un resultado similar para la ejecución 2. La concentración de proteína adherida a las membranas PSU-TriN-NPs en la ejecución 2 fue de 4,40 μg/cm2 y fue significativamente menor que las membranas probadas (prueba t, P = 0,00) (Fig. 4D). La medición de proteínas se verificó adicionalmente por HPLC utilizando un detector de 280 nm. Los cromatogramas de HPLC mostraron que se observó un fragmento de proteína de un solo pico de 0,93 kDa en las corrientes de retenido y permeado de las tres membranas (Figura S7), aunque a una concentración más alta en la ejecución 1 en comparación con la ejecución 2. Por el contrario, los perfiles de fragmentos de proteína en el La matriz de biopelícula de las tres membranas fue muy diferente de la observada en las corrientes de retenido y permeado. Los perfiles de fragmentos de proteína en las membranas tenían un peso molecular (MW) que oscilaba entre 0,15 kDa y 661,7 ± 40,2 kDa en el ciclo 1. Solo se pudo detectar el peso molecular de 661,7 kDa en la membrana PSU-TriN-0 % en el ciclo 2 y el paladio restante -las membranas modificadas no tenían fragmentos detectables (Figura S7).

La concentración promedio de ATP en la matriz de biopelícula adherida a la membrana PSU-TriN-NPs fue de aproximadamente 133,59 ± 21,4 pmol/cm2 en la ejecución 1 y 116,60 ± 18,37 pmol/cm2 en la ejecución 2 (Fig. 5A, B). La presencia de nanopartículas de Pd en la membrana PSU-TriN disminuyó significativamente la concentración de ATP tanto en la ejecución 1 como en la ejecución 2 (prueba t, P = 0,00). La concentración promedio de AI-2 de las membranas PSU-TriN-0% y PSU-TriN-94% fue de 3,18 y 3,88 nmol/cm2, respectivamente, y disminuyó a 0,72 nmol/cm2 en la membrana PSU-TriN-NPs en el ciclo 1 (Fig. 5C). En la ejecución 2, las concentraciones promedio de AI-2 en la membrana PSU-TriN-0% fueron 6 y 24 veces más altas que las detectadas en las membranas PSU-TriN-94% y PSU-TriN-NPs, respectivamente (Fig. 5D).

Medición de ATP y AI-2 en EPS adjuntos en PSU-TriN-0%, PSU-TriN-94 y PSU-TriN-NPs.

(A) Concentración de ATP de la ejecución 1; (B) Concentración de ATP de la serie 2; (C) cantidad de AI-2 de la corrida 1; (D) AI-2 cantidad de corrida 2.

La presencia de una concentración del 94 % de triazoles (es decir, PSU-TriN-94 %) y nanopartículas de Pd (es decir, PSU-TriN-NP) en la membrana de PSU-TriN-0 % dio como resultado una comunidad microbiana diferente (Figura S8, ANOSIM, R = 0,889 en el ensayo 1 y R = 0,815 en el ensayo 2, P = 0,1). Para ilustrar, la abundancia relativa de Acidobacteria Gp4 sin clasificar, que es un grupo predominante detectado en la matriz del biofilm, representó el 12,4 % de la comunidad microbiana total en PSU-TriN-NP en el ciclo 1. Esta abundancia relativa fue un 35 % menor que la de PSU-TriN-0%. En la ejecución 2, la misma Acidobacteria Gp4 sin clasificar también fue un 52 % más baja en abundancia relativa en PSU-TriN-NP que en PSU-TriN-0 %. Otro género predominante, Acinetobacter, se vio disminuido por la presencia de triazoles y NPs. La abundancia relativa fue del 6,2 % en PSU-TriN-0 %, que fue 3,6 veces y 2,4 veces mayor que la de PSU-TriN-NP, respectivamente, en el ciclo 1 y el ciclo 2. Varias OTU que se identificaron como afiliadas con Acidobacteria, Acinetobacter y Chitinophagaceae exhibieron una menor abundancia relativa cuando se utilizó la membrana PSU-TriN-NPs. Por ejemplo, la abundancia de Blastocatella fastidiosa, que está afiliada a la Acidobacteria, estuvo presente en una abundancia relativa del 10,0 % en PSU-TriN-0 % y fue 1,5 veces mayor que en PSU-TriN-NP. De manera similar, en la ejecución 2, su abundancia en PSU-TriN-NP disminuyó 1,9 veces en comparación con PSU-TriN-0% (Tabla 2). Se pueden obtener resultados similares para otras UTO afiliadas a Acidobacteria (p. ej., Blastocatella fastidiosa), Acinetobacter (p. ej., Acinetobacter guillouiae) y Chitinophagaceae (p. ej., Terrimonas lutea) (Tabla 2).

Este estudio ha demostrado sistemáticamente que la funcionalización de ligandos de triazol en membranas de PSU poliméricas puede producir efectos antibacterianos. El acoplamiento de nanopartículas de paladio en la misma membrana funcionalizada con triazol (Figura S9) puede mejorar aún más los efectos antibacterianos y retrasar la aparición de incrustaciones en la membrana cuando se conecta a un biorreactor de membrana aeróbico a escala de laboratorio.

El uso de metales pesados, generalmente plata y cobre, pero no paladio, en membranas poliméricas para lograr un efecto antibacteriano se había propuesto en estudios anteriores18,19,20,21. Por ejemplo, se ha informado que las nanopartículas de Ag muestran altos efectos biocidas cuando se funcionalizan en membranas de ósmosis directa y membranas de copolímero de bloque7,8,21. También se funcionalizaron nanopartículas de cobre en una membrana compuesta de película delgada para lograr efectos antibacterianos18. También se había hecho una propuesta similar para usar ligandos de triazol para inhibir la cantidad de células intactas unidas a las membranas. Por ejemplo, Duong y colaboradores introdujeron el uso de politriazol en membranas funcionalizadas con hidroxilo y demostraron los efectos antibacterianos y antiadherentes de dichas membranas16. Tejero et al. también mostró que los copolímeros que contenían grupos funcionales triazol exhibieron altos efectos biocidas contra muchos microorganismos (por ejemplo, levadura, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa)22.

A diferencia de los estudios que evaluaron los efectos antibacterianos de las membranas modificadas utilizando un modelo bacteriano de monocultivo, este estudio proporcionó un enfoque multifacético para comprender los mecanismos detrás de los efectos antibacterianos y antiincrustantes de dichas membranas modificadas. Primero, los ligandos de triazol pueden disminuir significativamente la proporción de bacterias vivas/muertas adheridas a la membrana (Fig. 1). De manera similar, los ligandos también inhibieron de manera efectiva el crecimiento de bacterias (Figura S3) tanto en la porción débilmente unida como en el total de la biopelícula en condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas. Esto contrasta con la membrana PSU-TriN-0% no modificada que tenía una porción relativamente mayor de células intactas en la porción fuertemente unida de la biopelícula (Figura S3). Este hallazgo sugiere que la membrana PSU-TriN-0% era más propensa a la adhesión celular por bacterias, probablemente debido a la hidrofobicidad relativamente mayor de esta membrana en comparación con las funcionalizadas con triazoles23 (Tabla 1). Sin embargo, no hubo una mejora significativa en el alcance de la actividad antibacteriana derivada de las diferentes concentraciones de triazoles funcionalizados en las membranas de la fuente de alimentación. Esto se ejemplifica a partir de la ausencia de cualquier reducción significativa en los polisacáridos totales, la proporción viva/muerta y la enumeración de células vivas con concentraciones crecientes de triazol, lo que sugiere que la actividad del triazol no es un factor limitante para lograr el efecto antibacteriano. En cambio, se requiere una combinación con otros materiales, por ejemplo, nanopartículas de paladio, para mejorar aún más el efecto antibacteriano.

La inhibición del crecimiento celular afectó posteriormente a la producción de polisacáridos bacterianos en la matriz del biofilm (Fig. 2A,B). Los polisacáridos y las proteínas constituyen los principales componentes de la sustancia polimérica extracelular (EPS), que a su vez representan el 90 % del peso seco de una matriz de biopelícula24. Por lo tanto, es probable que la reducción de polisacáridos dé como resultado una formación retardada de biopelícula en la membrana. Sin embargo, el efecto inhibitorio sobre las proteínas no fue consistente en los experimentos de monocultivo y biopelícula de especies mixtas. PSU-TriN-NP puede disminuir significativamente la cantidad de proteína en la matriz de biopelícula de especies mixtas (Fig. 4C, D), mientras que la presencia de diferentes concentraciones de ligandos de triazol no resultó en una reducción significativa de la concentración de proteína en comparación con el control (Fig. 3A). La adición de paladio (es decir, iones, NP) tampoco resultó en una reducción significativa de la concentración de proteína en el biofilm de especies de monocultivo (Fig. 3C, D). Dado que se usó caldo LB para establecer la biopelícula de monocultivo, la alta concentración de contenido de proteína en este medio puede haber contribuido a la interferencia de fondo al usar el método de Lowry para cuantificar el contenido de proteína en ciertos casos. Alternativamente, debido a que el método utilizado (es decir, el método de Lowry) para cuantificar el contenido de proteínas no es capaz de distinguir entre las proteínas que se eliminan por lisis de las células bacterianas muertas y las asociadas con las membranas celulares intactas, es posible que el alto contenido de proteínas asociado con el las membranas modificadas eran proteínas intracelulares lisadas de células bacterianas muertas.

En cambio, el contenido de proteína en el experimento AeMBR mostró una diferencia significativa entre las membranas modificadas y PSU-TriN-0% (Fig. 4). Dada la baja concentración de proteína en SMP (Figura S6), puede haber menos interferencia en el método de Lowry a diferencia del experimento de biopelícula de monocultivo. Para verificar, se utilizó HPLC como método alternativo para detectar y medir fragmentos de proteína en una matriz de biopelícula de especies mixtas. Dado que el mecanismo de detección de la HPLC se basa en la cromatografía líquida, no está sujeto a las mismas limitaciones que el método de Lowry. Con este método alternativo, se demostró que los fragmentos de proteína medidos en las membranas modificadas eran apenas detectables (Fig. 4 y Figura S7), lo que indica que las membranas modificadas con triazol y Pd NP podrían disminuir la cantidad de proteínas.

Además de afectar la producción de polisacáridos y proteínas, la inhibición del crecimiento de células bacterianas también se correlacionó con una disminución consecuente en las concentraciones de ATP y AI-2 por unidad de superficie, las cuales pueden usarse como parámetros para indicar la cantidad de biomasa. Además de comparar las proteínas en EPS soluble extraídas de la biopelícula en PSU-TriN-0%, se observó que las distribuciones de peso molecular de las proteínas eran claramente diferentes de las detectadas en SMP (Figura S7). Esto sugiere que ciertas porciones de proteína en EPS no provienen de la absorción directa de proteínas de SMP sino que surgen de la actividad bacteriana. Tal actividad no fue evidente en las membranas modificadas como se observó por la clara falta de fragmentos proteicos detectables. El cambio en el nivel de bioactividad probablemente se debió a cambios en las comunidades microbianas en las membranas modificadas que son distintas de la membrana de control (Figura S8). Para ilustrar, la abundancia relativa de Acidobacteria sin clasificar, Chitinophagaceae sin clasificar y Acinetobacter fue menor en presencia de triazol y paladio. Terrimonas lutea se identificó además en el nivel de OTU como consistentemente más bajo en presencia de las membranas modificadas en comparación con la membrana de control (Tabla 2). Estudios previos reportaron que la familia Chitinophagaceae era abundante en la biopelícula del tubo de cobre en el sistema de distribución de agua potable25. Se informó además que Chitinophagaceae no clasificada, incluida Terrimonas rubra, estaba involucrada en la unión a la membrana aeróbica y que su abundancia aumentaba con la extensión del ensuciamiento de la membrana26. De manera similar, se informó que los géneros Acinetobacter y Acidovorax se correlacionan con la formación de biopelículas y con la abundancia de moléculas de señal de detección de quórum27,28 (Tabla 2). La menor abundancia relativa de tales grupos bacterianos por parte de las membranas modificadas sugiere una acumulación y formación más lentas de biopelícula bacteriana en estas membranas.

Colectivamente, la disminución en el número de células intactas (es decir, células viables), contenido de polisacáridos y proteínas dentro de la matriz de biopelícula adherida a las membranas demostró el efecto antibacteriano de las membranas modificadas. Estos hallazgos explicaron el incremento más lento de TMP cuando las membranas modificadas se conectaron a MBR aeróbico, lo que sugiere que las membranas son menos propensas a la bioincrustación. Esto es a pesar de la adición de iones Pd y nanopartículas en las membranas que dieron como resultado una topografía superficial más rugosa (Figura S10, Tabla 1). Anteriormente se demostró que las membranas con una superficie más rugosa son más propensas a ensuciarse, ya que la rugosidad puede aumentar la posibilidad de interacción entre las células y la superficie y mejorar la adhesión de las bacterias23,29. Independientemente, nuestras observaciones sugieren que las nanopartículas de Pd y, en menor medida, los iones de Pd, tenían efectos antibacterianos, ya que la presencia de Pd en combinación con triazol no solo contrarrestaba la influencia de una topografía más accidentada sino que también mejoraba los efectos antiincrustantes.

En conclusión, los resultados de este estudio demostraron que la modificación de 1,2,3-triazol puede inhibir el crecimiento bacteriano y disminuir la cantidad de polisacáridos y proteínas. La membrana de triazol incrustada con nanopartículas de paladio demostró un efecto sinérgico en sus efectos antibacterianos. Cuando se conectaron a un biorreactor de membrana aeróbico, las membranas modificadas pudieron reducir la presión transmembrana y retrasar el proceso de bioincrustación de la membrana.

En este estudio se evaluaron seis tipos de membranas PSU. Estos incluyeron cuatro concentraciones diferentes de triazol (es decir, 0 %, 23 %, 49 % y 94 %) funcionalizados en membranas de PSU y denominados PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 %. , PSU-TriN-94% en este estudio. Debido al hecho de que solo la membrana PSU-TriN-94 % puede incrustar iones y nanopartículas de Pd, las membranas PSU-TriN-94 % que contienen iones de paladio (PSU-TriN-Ions) o nanopartículas de paladio (PSU-TriN-NP) fueron evaluado en este estudio. Se sintetizó PSU-TriN con diferentes concentraciones de triazol en base a un método publicado30. Brevemente, se clorometiló polisulfona en presencia de anillos de fenilo y se incorporaron anillos de 1,2,3-triazol disustituidos en 1,4 mediante cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (I). Las membranas PSU-TriN-0%, PSU-TriN-23%, PSU-TriN-49% y PSU-TriN-94% se fabricaron mediante separación de fases inducida sin disolvente (es decir, agua) y soluciones de polímero al 20% en peso en N, N-dimetilacetamida (DMAc). En todas las síntesis, las películas de solución de polímero con un grosor de hasta 200 μm se colaron sobre el soporte de poliéster no tejido. Las membranas PSU-TriN-Ions y PSU-TriN-NPs se fabricaron mediante separación de fases inducida por complejación31 utilizando acetato de Pd(II) (Pd(OAc)2) como fuente de paladio. Brevemente, se vertió una película de 200 μm de solución de polímero (20% en peso de PSU-TrN-94% en DMAc) sobre un soporte no tejido; y la película de solución de polímero resultante se sumergió durante 3 s en una solución 36 mM de Pd(OAc)2 en DMAc para formar la capa superior rica en paladio. Finalmente, el polímero se sumergió en un baño de agua para formar el soporte poroso libre de paladio. En este punto, se obtuvo la membrana PSU-TriN-Ions. Se realizó un paso de reducción adicional para reducir los iones de paladio a nanopartículas. Este paso consistió en sumergir PSU-TriN-Ions durante 5 min en una solución 0,05 M de tetrahidroborato de sodio (NaBH4), obteniendo así la membrana PSU-TriN-NPs. Se había encontrado previamente que las membranas PSU-TriN-NPs sintetizadas de esta manera estaban bien distribuidas solo en la capa superior de la membrana polimérica donde se encuentran los precursores (es decir, triazol)32. La capa uniforme de nanopartículas de Pd en la superficie de la membrana de PSU-TriN-NP pero no en las membranas de PSU-TriN-Ions se muestra con más detalle en las Figuras S10 y S11. Todas las membranas se mantuvieron en agua desionizada estéril antes de su uso.

El microscopio electrónico de barrido (SEM) FEI Nova Nano y el microscopio electrónico de transmisión (TEM) Titan 80–300 CT de campo oscuro (Oregón, EE. UU.) se utilizaron para observar la superficie de las membranas a 5 kV y 300 kV, respectivamente. El microscopio TEM también estaba equipado con un detector de espectroscopia de dispersión de energía (EDS) de rayos X, una cámara de dispositivo acoplado por carga y un filtro de energía posterior a la columna. Para preparar la muestra para SEM, un trozo de muestra de membrana se secó al aire y luego se fijó en un trozo de aluminio plano. Se pulverizó iridio de 3 nm de espesor sobre la superficie de la membrana mediante un recubridor de bombardeo iónico K575X Emitech (Quorum Technologies, Reino Unido). Para preparar la muestra para TEM, las membranas se incluyeron en resina epoxi de baja viscosidad (Agar R1165) y se curaron a 60 °C durante 24 h. Se prepararon secciones ultrafinas (100 nm) con un ultramicrótomo (Leica EM UC6) y se colocaron en una rejilla de cobre (malla 180). Se utilizó microscopía de fuerza atómica (AFM) para caracterizar la topografía de la superficie de la membrana. La membrana secada al aire se fijó en un portaobjetos de vidrio. Las imágenes de AFM se realizaron con un equipo Bruker Dimension ICON (Santa Barbara, CA, EE. UU.) en un modo de toque suave. Para cada membrana, se escaneó una imagen con 5 μm de ancho y 5 μm de largo. El ángulo de contacto se midió para cuantificar la hidrofilia de las membranas mediante el analizador de forma EasyDrop (Krüss, Hamburgo, Alemania) en modo estático a temperatura ambiente. Se utilizó agua ultrapura como líquido de sondeo y los valores medios se determinaron a partir de tres especímenes independientes diferentes.

Se utilizó un reactor de biopelícula de flujo por goteo (DFR) (Biosurface Technologies, Bozeman, MT, EE. UU.) para establecer una biopelícula de monocultivo en las membranas. Los métodos y condiciones fueron los descritos previamente33,34. Brevemente, se inoculó P. aeruginosa PAO1 en 20 ml de caldo LB (Lennox) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y el cultivo de crecimiento se incubó en una incubadora con agitador de 200 rpm durante 24 h a 37 °C. Después de eso, el cultivo bacteriano se diluyó con caldo LB a una densidad óptica de 600 nm (OD600) de 0,07. Esta medida de DO a una longitud de onda de 600 nm corresponde a una densidad celular aproximada de 108 células/mL. Las membranas se unieron a cupones de policarbonato y se probaron por duplicado. Luego, los cupones se colocaron en canales individuales de DFR esterilizado en autoclave y se incubaron durante 10 horas a 37 °C. En condiciones anaeróbicas, se añadió nitrato de potasio al 1 % p/v al caldo LB para asegurar el crecimiento de P. aeruginosa PAO1 en presencia de nitrato como aceptor de electrones alternativo35. Las membranas se recolectaron después de 48 h de cultivo en presencia de un flujo continuo de 0,8 ml/min de caldo LB en condiciones aeróbicas y después de 72 h de cultivo debido a una tasa de crecimiento más lenta en condiciones anaeróbicas. Se realizaron dos carreras en el DFR en condiciones aeróbicas y dos carreras en condiciones anaeróbicas.

En este estudio también se utilizó un AeMBR de flujo ascendente adjunto (UA) con las mismas condiciones operativas descritas anteriormente26 para establecer un consorcio bacteriano mixto en las membranas. Se conectaron al reactor en serie tres módulos externos de membrana de hoja plana de flujo cruzado (es decir, PSU-TriN-0%, PSU-TriN-94%, PSU-TriN-NPs). Cada membrana se operó con un flujo transmembrana constante de 6 a 8 LM-2 h-1 (LMH) bajo un tiempo de retención hidráulica promedio (TRH) de 18,5 h. Todas las membranas se recolectaron simultáneamente cuando cualquiera de las tres membranas mostró un ensuciamiento crítico. Los productos microbianos solubles (SMP), incluido el permeado de cada membrana y el retenido en el reactor, se tomaron muestras semanalmente durante toda la operación según el protocolo descrito anteriormente26. Se realizaron dos corridas en el AeMBR para asegurar la reproducibilidad de los resultados.

Para los experimentos DFR, las membranas duplicadas en cada serie se recogieron y manipularon de forma ligeramente diferente. Brevemente, una membrana se lavó con 40 ml de PBS 1X para eliminar la biopelícula débilmente unida y la membrana se mantuvo posteriormente para el análisis microscópico confocal; y la otra membrana se colocó en 40 ml de PBS sin ningún paso de lavado previo (es decir, se recogieron biopelículas tanto sueltas como fuertemente unidas). Los tubos que contenían la biopelícula débilmente unida y la biopelícula total se ultrasonicaron individualmente durante 3 min con un sonicador Q500 (Qsonica, Newton, CT, EE. UU.) al 25 % de amplitud con intervalos pulsantes de 2 s para dispersar la biopelícula en la suspensión líquida. A continuación, se retiraron las membranas de la suspensión líquida. Una parte de la suspensión se utilizó para el recuento de células vivas y el polisacárido Pel, mientras que el resto se filtró a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 μm para la caracterización de polisacáridos y proteínas.

Para los experimentos de AeMBR, cada membrana recolectada con un área de 20 cm por 2,5 cm se cortó asépticamente en tres partes iguales. Cada porción se nombró como entrada, medio y salida, respectivamente, según la dirección del flujo de aguas residuales. Cada porción se subdividió adicionalmente para la cuantificación de ATP y las mediciones de EPS solubles. Para preparar las mediciones de EPS soluble, cada subporción de membrana se sumergió respectivamente en 6 ml de PBS 1X. Las membranas se sometieron a ultrasonidos de manera similar a la descrita anteriormente. Luego se retiraron las membranas y las suspensiones restantes se centrifugaron a 9400 g durante 20 min antes de la filtración a través de acetato de celulosa de 0,22 μm. Los sedimentos celulares obtenidos después de la centrifugación se almacenaron para la extracción de ADN y el análisis de la comunidad microbiana.

Se usaron dos métodos para enumerar las células vivas dentro del biofilm de monocultivo establecido en las membranas de la PSU. Primero, se alícuota de 1 ml de la suspensión líquida y se diluyó de 5000 a 7000 veces en PBS 1X para citometría de flujo en Accuri C6 (BD Bioscience, NJ, EE. UU.). Se utilizó el kit de recuento y viabilidad bacteriana LIVE/DEAD® BacLightTM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para teñir las bacterias según el protocolo del fabricante. Brevemente, se agregaron 300 μL de yoduro de propidio 2X: colorante Syto9 con concentraciones respectivas de 30 μM y 6 μM a 300 μL de suspensión líquida diluida y se incubó a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 15 min antes de la citometría de flujo. Se inyectaron 50 μL de muestras teñidas con una velocidad de 35 μL/min para enumerar las células con paredes celulares intactas (es decir, células vivas). En segundo lugar, las membranas con la biopelícula fuertemente unida se tiñeron con el kit de recuento y viabilidad bacteriana LIVE/DEAD® BacLightTM durante 20 min. Se utilizó Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania) con objetivo de aumento 20X. El escaneo de imágenes se realizó con la línea láser de 488 nm y 561 nm de un láser Ar/Kr. Se obtuvieron 7 imágenes diferentes para cada membrana y las imágenes fueron analizadas por el software Image J36. Durante el análisis, cada imagen se dividió en dos imágenes según los canales rojo y verde de células vivas y muertas, respectivamente. Luego, las células muertas y las células vivas se contaron individualmente para determinar la proporción viva/muerta.

Pseudomonas aeruginosa PAO1 es capaz de producir exopolisacáridos Pel, Psl y alginato17. Estos exopolisacáridos son importantes para proporcionar el andamiaje estructural del biofilm de P. aeruginosa37 y se anticipa que serán los polisacáridos predominantes dentro de la matriz del biofilm de monocultivo. Los polisacáridos se midieron mediante tinción congo en base a la descripción anterior con una ligera modificación. Brevemente, antes del análisis, la suspensión líquida se agitó brevemente para asegurar la homogeneidad en los contenidos. Se centrifugaron 10 mL de la suspensión homogénea a 9400 g por 10 min y se descartó su sobrenadante. El sedimento celular se resuspendió en 10 ml de caldo LB rojo congo de 40 mg/ml y se incubó durante 90 min en una incubadora con agitación a 37 °C. Después de esto, la suspensión se centrifugó nuevamente a 9400 g durante 10 min y se midió la DO490 del sobrenadante. Se midió el rojo congo total absorbido en el sobrenadante. El caldo LB que contenía 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml y 80 mg/ml de rojo congo también se analizó mediante OD490 para establecer una curva estándar para calcular la concentración de congo en el sobrenadante.

El sobrenadante primero se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm (VWR US, Radnor, PA, EE. UU.) antes de la determinación de su PN y PS. La PN se cuantificó mediante el Total Protein Kit, Micro Lowry, Peterson's Modification (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) basado en el método de Lowry38, con 0 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg /mL y 80 μg/mL de albúmina de suero bovino (BSA) como estándar y medida por triplicado. BSA se originó en Nueva Zelanda y se comercializó a través de Sigma-Aldrich en polvo liofilizado con el número CAS 9048-46-8. PS se determinó por el método de fenol-ácido sulfúrico. Se utilizaron como estándares glucosa de 0 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL y 80 μg/mL39. El análisis de peso molecular (MW) de proteínas en SMP y EPS se realizó en un sistema HPLC Water BreezeTM 2 (Waters Chromatography, Milford, MA, EE. UU.) basado en los procedimientos descritos por Xiong et al.26.

Se cuantificaron el trifosfato de adenosina (ATP) y el autoinductor-2 (AI-2) para medir la cantidad de biomasa en las membranas. La membrana de dimensiones 1 cm por 2,5 cm se colocó en 2 ml de agua desionizada, ultrasonicada durante 2 min al 25 % de amplitud con intervalos pulsantes de 2 s. El contenido de ATP en la suspensión se cuantificó mediante el kit de reactivos Celsis Amplified ATP TM en un luminómetro Advance (Celsis, Westminster, London, UK) con agua desionizada como control negativo. Todas las muestras se midieron por triplicado. El AI-2 de la suspensión líquida de las membranas recolectadas se determinó con base en un protocolo previo26.

El ADN genómico de los pellets obtenidos de la extracción de EPS soluble se extrajo con el UltraClean® Soil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, EE. UU.) con ligeras modificaciones40. La amplificación por PCR de los genes 16S rRNA se aplicó con 515F (5′- Illumina overhang- GTGYCAGCMGCCGCGGTAA- 3′) y 907R (5′- Illumina overhang- CCCCGYCAATTCMTTTRAGT- 3′). Todos los amplicones tenían el tamaño previsto de aproximadamente 550 pb y el control negativo no tiene amplificación. Los amplicones de PCR se limpiaron con perlas AMPure XP (Beckman Coulter, CA, EE. UU.). Después de eso, se realizó Index PCR para adjuntar índices duales proporcionados por el Nextera XT Index Kit (Illumina Inc, San Diego, CA, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Los amplicones de PCR indexados se limpiaron con perlas AMPure XP (Beckman Coulter, CA, EE. UU.). Las concentraciones equimolares de las muestras se mezclaron y enviaron al laboratorio KAUST Core para la secuenciación de Illumina MiSeq. Los datos de secuenciación fueron procesados ​​por su calidad y analizados por el mismo enfoque que se especifica en el estudio anterior41.

Primer E versión 742 analizó el grado de similitudes de las comunidades microbianas adheridas a los tres tipos de membranas. Brevemente, las abundancias de los géneros bacteriano y archaeal se ingresaron en Primer E versión 7 y se transformaron en raíces cuadradas antes de calcular su Bray. -Similitudes de Curtis. A continuación, se utilizó la matriz de similitudes de Bray-Curtis para construir un gráfico de escalado multidimensional de umbral no métrico (nMDS) mediante análisis multivariado. Los objetivos bacterianos que exhibieron una correlación >0.7 con los patrones multivariados en el nMDS se superpusieron como vectores. Se utilizó el análisis ANOSIM para determinar si los grupos observados en nMDS eran significativamente diferentes. Todas las demás pruebas de significación se analizaron mediante la prueba t de dos colas en Microsoft Excel 2013 y Prism 6.

Todos los archivos de secuenciación de alto rendimiento se depositaron en el Archivo de Lectura Corta (SRA) del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con el número de acceso del estudio PRJEB12586.

Todos los protocolos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas aprobadas y fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad y Bioética, KAUST.

Cómo citar este artículo: Cheng, H. et al. Efecto antibiopelícula mejorado por la modificación de nanopartículas de 1,2,3-triazol y paladio en membranas de polisulfona. ciencia Rep. 6, 24289; doi: 10.1038/srep24289 (2016).

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Los autores desean agradecer a Moustapha Harb y al Dr. Yanghui Xiong por su asistencia técnica y orientación. Los autores expresan su más sincero agradecimiento al Dr. Manuel A. Roldan del laboratorio central de imágenes y caracterización de KAUST por brindar asistencia técnica en la adquisición de las imágenes STEM-EDX. Este estudio cuenta con el apoyo de la financiación KAUST CCF FCC/1/1971-06-01 otorgada a P.-Y. Hong.

Instituto de Tecnología Verde e Inteligente de Chongqing, Academia de Ciencias de China, Chongqing, 401122, China

Canción de Hong Cheng y Liyan

División de Ingeniería y Ciencias Biológicas y Ambientales (BESE), Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah (KAUST), Centro de Desalinización y Reutilización de Agua (WDRC), Thuwal, 23955-6900, Arabia Saudita

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Luis Francisco Villalobos & Klaus-Viktor Peinemann

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HC y PYH concibieron y diseñaron los experimentos; YX y LFV fabricaron las membranas y realizaron la caracterización microscópica de las membranas; HC realizó el muestreo y los experimentos; HC y PYH analizaron los datos; PYH, LS, KVP y SN contribuyeron con reactivos/materiales/herramientas de análisis/mano de obra; HC y PYH contribuyeron a la redacción del manuscrito y preparación de figuras. Todos los autores leyeron y aprobaron esta presentación.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Cheng, H., Xie, Y., Villalobos, L. et al. Efecto antibiopelícula mejorado por la modificación de nanopartículas de 1,2,3-triazol y paladio en membranas de polisulfona. Informe científico 6, 24289 (2016). https://doi.org/10.1038/srep24289

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Recibido: 24 febrero 2016

Aceptado: 24 de marzo de 2016

Publicado: 12 abril 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24289

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Microbiología Aplicada y Biotecnología (2017)

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