Se requieren regiones del virus de la hepatitis C E2 para la asociación de membranas | Orgullo Co., Ltd de Nanning del pavo real

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 433 (2023) Citar este artículo

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El virus de la hepatitis C (VHC) utiliza un mecanismo de entrada híbrido. Los datos estructurales actuales sugieren que tras la exposición a un pH bajo y al grupo de diferenciación 81 (CD81), el extremo amino de la glicoproteína E2 de la envoltura se ordena y libera un bucle interno con dos residuos aromáticos invariantes en la membrana huésped. Aquí, presentamos la estructura de un E2 truncado en el extremo amino con el bucle de unión a la membrana en una conformación doblada y las cadenas laterales aromáticas secuestradas. La comparación con tres estructuras E2 informadas anteriormente con el mismo Fab indica que este bucle interno es flexible y que el contexto local influye en la exposición de los residuos hidrofóbicos. Los ensayos bioquímicos muestran que el E2 truncado en el extremo amino carece de la capacidad de unión a la membrana de referencia del ectodominio E2. Por lo tanto, la región amino terminal es un determinante crítico tanto para la interacción de CD81 como de la membrana. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre el mecanismo de entrada del VHC.

Hepatitis C virus (HCV) is a leading cause of chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma with significant morbidity and mortality rates in humans1. The World Health Organization estimates that there are 1.5 million new HCV infections each year and 58 million people worldwide are chronically infected (2021)." href="/articles/s41467-023-36183-y#ref-CR2" id="ref-link-section-d85794354e485">2. In the United States, annual acute HCV infections increased by 387% from 2010 to 2019 in association with rising addiction to intravenously administered opioids (2019)." href="/articles/s41467-023-36183-y#ref-CR3" id="ref-link-section-d85794354e489"> 3. Los medicamentos antivirales de acción directa recientemente aprobados son altamente efectivos contra todos los genotipos de HCV4, pero una vez curados, una persona puede volver a infectarse. En el contexto de la adicción y el uso de drogas por vía intravenosa, la protección duradera contra la infección por el VHC es una necesidad médica no satisfecha.

El grupo de diferenciación 81 (CD81)5, el receptor depurador clase B tipo I (SR-BI)6, la claudina-1 (CLDN)7 y la ocludina (OCLN)8 son factores celulares necesarios para la entrada del VHC. El bloqueo de la unión del VHC a CD81 es el principal medio de neutralización mediada por anticuerpos9. CD81 se expresa de manera ubicua en una variedad de líneas celulares, lo que sugiere un papel secundario a la unión al receptor específico de hepatocitos10,11. CD81 es una proteína de membrana integral con cuatro hélices transmembrana y dos bucles extracelulares, denominados bucle extracelular pequeño y grande (SEL y LEL, respectivamente). El tratamiento con pH bajo no inactiva el VHC12. La incubación tanto con CD81-LEL como con un pH bajo crea un cambio conformacional en el VHC que disminuye irreversiblemente la capacidad del virus para ingresar a las células permisivas13. El pretratamiento con tampón de pH bajo o CD81-LEL aumenta la infectividad del VHC, lo que indica que cada una de estas condiciones representa un paso de preparación necesario13.

Mientras que las glicoproteínas 1 y 2 de la cubierta del VHC (E1 y E2) median la unión y entrada del receptor, E2 interactúa específicamente con CD81 y SR-BI5,6. E2 es una proteína de membrana de tipo I con una glicoproteína soluble amino (N) terminal y una hélice transmembrana (TM) carboxi (C) terminal (Fig. 1a). Tenga en cuenta que la numeración se basa en la secuencia J6 (genotipo 2a), estudiada aquí, y varía ligeramente entre los genotipos. El E2core central es un dominio plegado globular que incluye un sándwich de inmunoglobulina estabilizada con disulfuro flanqueado por la región hipervariable 1 (HVR1), el sitio antigénico (AS) 412, la capa frontal y HVR2 en el extremo N y una región de tallo en el C-terminal14 (Fig. 1a). La arquitectura general del E2core (residuos 460–646) incluye una lámina interna tipo sándwich β de inmunoglobina central (residuos 485–519) seguida de un bucle de unión a CD81 (residuos 520–539) y una hoja tipo sándwich β corta (residuos 540 –570). El E2core conserva la arquitectura E2 general del ectodominio, pero no puede unirse a CD8115.

a Representación esquemática de E2 de longitud completa (aislado J6, genotipo 2a) y varios fragmentos utilizados en estudios estructurales y funcionales. b Estructura cristalina de rayos X de E2core+stem (PDB ID: 8DK6). El modelo final consta de los residuos 491–571 y 596–653 de E2core+stem (c) La estructura E2core (PDB ID: 4WEB) consta de los residuos 488–522, 538–571 y 596–649. d La estructura eE2 (PDB ID: 7MWW) consta de los residuos 422–453, 490–571 y 596–650, y e ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL (PDB ID: 7MWX) consta de los residuos 418–453, 490– 571 y 597–650. Cada estructura (b-e) se determinó en presencia del anticuerpo Fab 2A12 no neutralizante (no se muestra). Los residuos de la cadena pesada y de la cadena ligera de 2A12 Fab constan de los residuos 1–219 y 1–218, respectivamente. La región del bucle de unión a CD81 (520–539) está codificada por colores de acuerdo con E2core+stem, E2core, eE2, ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL y capa frontal con rojo, cian, azul, verde y trigo, respectivamente. Tyr529, Trp531 residuos en la punta del bucle de unión a CD81 e Ile422 de la capa frontal también se destacan. Las regiones desordenadas se representan con una línea discontinua. La orientación E2 en b–e es aproximadamente la misma. Se da la numeración de residuos para cada cadena construida en los modelos estructurales finales.

Recientemente, se informaron las estructuras de E2 en presencia y ausencia de tití huésped no productivo CD81-LEL (tCD81-LEL) a pH bajo16. En ausencia de CD81, el ectodominio de E2 (eE2) tiene un bucle interno (el bucle de unión a CD81) metido contra Ile422 de la capa frontal. Al unirse a CD81 a pH bajo, eE2 sufre dos cambios conformacionales: la capa frontal interactúa con CD81 plegando AS412 alrededor de CD81, y el bucle de unión a CD81 se aleja del núcleo. El bucle de unión a CD81 presenta dos residuos hidrofóbicos invariantes (Tyr529 y Trp531) en la punta del bucle, que son fundamentales para la interacción con la membrana del huésped16.

Aquí caracterizamos el papel de la capa frontal y el tallo en CD81-LEL y la unión a la membrana. La cromatografía de exclusión por tamaño y un ensayo de flotación de liposomas demostraron que la capa frontal de E2 es una región crítica para la interacción tanto de CD81-LEL como de la membrana. Se determinó la estructura cristalina de rayos X del vástago E2core+, que carece de las regiones HVR1, AS412, capa frontal y TM (Fig. 1a), en presencia de un anticuerpo no neutralizante, 2A12. En la estructura, la región del tallo está desordenada mientras que el bucle de unión a CD81 tiene una conformación doblada, secuestrando los residuos Tyr529 y Trp531 dentro del centro del bucle. La extensión del bucle de unión a CD81 puede tener más matices de lo que se consideraba anteriormente y es probable que su flexibilidad desempeñe un papel importante en la entrada y fusión viral.

Todas las estructuras anteriores de HCV E2 determinadas por cristalografía de rayos X omitieron el tallo (646–712) y las regiones de anclaje TM (713–746) para aumentar la solubilidad y estabilidad de la proteína para la formación de cristales15,16,17,18,19,20. Para comprender el papel estructural de la región del tallo, se realizaron ensayos de cristalización en varios fragmentos E2 en presencia y ausencia del Fab 2A12. Los cristales del fragmento E2core+stem (456–713) unidos a 2A12 Fab se determinaron con una resolución de ~2,5 Å (Tabla 1). El modelo final consta de los residuos 491–571 y 596–653 de E2core+stem, así como los residuos de cadena pesada 1–219 y los residuos de cadena ligera 1–218 de 2A12 Fab. La alineación de la estructura E2core+stem con E2core, eE2 y el complejo ∆HVR1 eE2/tCD81-LEL produjo una desviación cuadrática media (RMSD) de 0,49 Å, 0,46 Å y 0,80 Å, respectivamente para posiciones alfa de carbono similares (Figura 1)15,16. La estructura E2core+stem no tenía una densidad interpretable para la mayor parte de la región del tallo (residuos 653–713). En la estructura reciente de E1E2, la región del tallo forma un complejo con E1, lo que sugiere que el plegamiento de esta región puede depender de E121. La estructura E2core+stem muestra una densidad de electrones continua para el bucle de unión a CD81 (residuos 520–539) (Fig. 2 complementaria), que es distinta de las estructuras informadas anteriormente (Fig. 1) y estabilizada por empaquetamiento de cristal (Fig. 2) .

a Se muestra la unidad asimétrica del complejo E2core+stem/2A12 Fab. b El empaquetamiento de cristal del complejo E2core+stem/2A12 Fab resalta una relación de simetría alrededor de un doble eje de rotación en la página (elipse negra). El bucle de unión a CD81 (rojo) se empaqueta contra una pareja de simetría, manteniendo el bucle en la conformación doblada. HC y LC se referían a la cadena pesada y la cadena ligera de 2A12 Fab, respectivamente.

La estructura E2core+stem representa la cuarta estructura de un fragmento E2 del aislado VHC J6 unido a la chaperona de cristalización 2A12 Fab15,16 (Fig. 1). Como resultado, la comparación de estructuras de diferentes longitudes E2 del mismo genotipo en presencia o ausencia de tCD81-LEL revela importantes detalles mecánicos. La principal diferencia estructural entre las cuatro estructuras E2 es la orientación del bucle de unión a CD81 (Fig. 1b-e). Eliminar el bucle de unión a CD81 del cálculo de superposición redujo el RMSD a menos de 0,3 Å para átomos alfa de carbono similares; por lo tanto, la presencia de la capa frontal, HVR1 y tallo no tiene efecto sobre el pliegue globular de la región central E2. El bucle de unión a CD81 en la estructura E2core+stem está doblado hacia la capa posterior de E2 (Figs. 1b y 3a).

a doblado (E2core+steam, PDB ID: 8DK6), b retraído (eE2) (PDB ID: 7MWW) yc extendido (ΔHVR1 eE2) (PDB ID: 7MWX) en tres orientaciones diferentes. Para mayor claridad, Y529, W531 e I422 están resaltados y no se muestra tCD81-LEL unido a c.

Para comprender mejor el alcance del movimiento del bucle de unión a CD81, el bucle se comparó con la región correspondiente de las otras estructuras E2. La eliminación de HVR1, AS412 y la capa frontal en la estructura E2core (PDB ID 4WEB) resultó en el desorden del bucle de unión a CD81 (Fig. 1c)15. En la estructura eE2, sin CD81, la capa frontal y específicamente el residuo Ile422 orienta el bucle de unión a CD81 en la posición retraída (Figs. 1d y 3b). En presencia de pH bajo y tCD81-LEL, la región AS412 de ΔHVR1 eE2 se ordena y el residuo Ile422 se mueve ~9 Å, coincidiendo con un bucle de unión a CD81 extendido (Figs. 1e y 3c). La distancia entre los residuos del bucle de unión a CD81, Tyr529 o Trp531, en E2core+stem (doblado) y eE2, que contiene la capa frontal, en ausencia de CD81-LEL (retraído) es ~17 Å y ~19 Å, respectivamente (Fig. 4a). La comparación del bucle de unión a CD81 extendido de ΔHVR1 eE2, del complejo con tCD81-LEL, con el vástago E2core + doblado demostró un movimiento de distancia de ~30 Å y ~22 Å de Tyr529 y Trp531, respectivamente (Fig. 4b). Además, la orientación del bucle se dobla en la dirección opuesta con respecto a CD81. Como referencia, se proporciona el movimiento del bucle de unión a CD81 en ausencia y presencia de tCD81-LEL (Fig. 4c).

La superposición de a el bucle de unión a CD81 doblado de E2core+stem (rojo) con el bucle de unión a CD81 retraído de eE2 (azul), b el bucle de unión a CD81 extendido de ΔHVR1 eE2 (verde) y el bucle de unión a CD81 doblado de E2core+stem (rojo), y c el bucle de unión a CD81 extendido de ΔHVR1 eE2 (verde) y el bucle de unión a CD81 retraído de eE2 (azul). b, c tCD81-LEL unido a ΔHVR1 eE2 (verde) no se muestra. Los residuos de la columna vertebral adyacentes son grises. La ubicación de las cadenas laterales Y529 y W531 se muestra como barras de heteroátomos y se proporcionan las distancias.

Debido a que el bucle de unión a CD81 estaba presente en cada una de las cuatro construcciones utilizadas en la determinación de la estructura, pero adopta conformaciones distintas concurrentes con los cambios en la capa frontal AS412/y la región del tallo, planteamos la hipótesis de que estas diferencias regulan la unión de CD81. E2core, solo, no se une a CD81-LEL humano (hCD81-LEL), mientras que eE2 se une a hCD81-LEL con menor afinidad en comparación con tCD81-LEL15. Por lo tanto, investigamos si la región del tallo E2 podría afectar la unión de hCD81-LEL. El tallo E2core+ se incubó con hCD81-LEL humano a pH bajo y posteriormente se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se usó un tampón de pH bajo ya que la afinidad de E2 por hCD81-LEL aumenta en presencia de pH16 bajo. La adición del tallo al E2core no logró unir hCD81-LEL en presencia o ausencia de 2A12 Fab (Fig. 1 complementaria). Estos resultados identifican la capa frontal como un determinante crítico para las interacciones CD81-LEL, de acuerdo con la reciente estructura eE2/tCD81-LEL16.

El eE2 del VHC exhibe una unión a la membrana inicial que aumenta tanto por la acidificación como por la interacción con CD81 y se elimina por mutación de Ile422, Tyr529 o Trp53113,16. Cualquiera de los dos modelos podría explicar la interacción entre la región N-terminal de E2 y el bucle de unión a CD81 para la inserción de la membrana (Fig. 5). Si la extensión del bucle de unión a CD81 es necesaria y suficiente para la unión a la membrana, la eliminación de la región N-terminal reguladora liberará el bucle de unión a CD81, lo que da como resultado una proteína E2 que se une a las membranas de manera eficaz en ausencia de CD81. Alternativamente, si la región N-terminal ayuda a presentar el bucle de unión a CD81 de una manera más propicia para la inserción en la membrana, la eliminación de la región N-terminal dará como resultado una proteína E2 que es incapaz de unirse a las membranas. Se usó un ensayo de flotación de liposomas para evaluar el efecto de la capa frontal y el tallo de E2 sobre la unión a la membrana. Brevemente, se incubó eE2, eE2+stem (Fig. 1a) o E2core+stem con liposomas en presencia o ausencia de tCD81-LEL a pH 5,0, se separó en un gradiente de sacarosa y se detectó mediante Western blot con un E2core específico. anticuerpo (Fig. 6, Fig. 3 complementaria). Se usó tCD81-LEL en el ensayo de flotación ya que el tití CD81 admite la infección por VHC y se une a E2 con mayor afinidad16,22,23. Las proteínas libres permanecen en la parte inferior del gradiente de sacarosa, mientras que las proteínas unidas a liposomas migran a la parte superior del gradiente. eE2 muestra una asociación espectacular de liposomas a pH bajo en presencia de tCD81-LEL, mientras que la adición de la región del tallo (eE2+stem) tiene un aumento más modesto en la señal con la adición de tCD81-LEL. Esto podría deberse a que la región del tallo (60 residuos) está desordenada en ausencia de E1, que inhibe la asociación con la membrana. Por el contrario, el tallo E2core+ no mostró asociación de membrana ni flotación a pH bajo independientemente de la presencia de tCD81-LEL. Una flotación de liposomas realizada en eE2 con o sin HVR1 mostró una unión equivalente a los liposomas a pH bajo en ausencia y presencia de tCD81-LEL. Por lo tanto, HVR1 tiene un efecto insignificante sobre la capacidad de E2 para interactuar con la membrana (Fig. 4 complementaria). Los resultados de los ensayos de flotación de liposomas (Fig. 6 y Fig. 4 complementaria) subrayan el importante papel que desempeña la capa frontal en la organización del bucle de unión a CD81 para la asociación de membranas. La flotación de eE2 es consistente con hallazgos previos de que la sustitución de alanina de Ile422 de la capa frontal (que linda con Tyr529 en la forma retraída del bucle de unión a CD81) falla en la asociación de membrana16. En la estructura E2core+stem, el bucle de unión a CD81 se dobla en la dirección opuesta con Tyr529 y Trp531 secuestrados dentro del bucle (Fig. 2 complementaria). En resumen, la capa frontal de E2, el receptor CD81 y el pH bajo son requisitos integrales para presentar correctamente el bucle de unión a CD81 para la unión a la membrana.

a La estructura CD81 humana de longitud completa (diagrama de cinta con las hélices transmembrana de color amarillo) y la molécula de colesterol coordinada (palos de heteroátomo de color verde claro) (PDB ID: 5TCX) se acoplaron en una bicapa de membrana de palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC) idealizada44. Los planos paralelos de esferas grises representan los restos de carbonilo que definen el núcleo hidrofóbico de la bicapa de la membrana, y los fosfolípidos representativos se acoplan a la bicapa y se muestran como barras de heteroátomos cian. Los diagramas de cinta de CD81-LEL (azul cielo) y bucle de unión a CD81 de estructuras extendidas (ΔHVR1 eE2) y dobladas (E2core+stem) se muestran en verde y rojo, respectivamente. b El panel es una ampliación del bucle de unión a CD81 y parte de la membrana que muestra las distancias relativas (líneas de puntos) de Tyr529 y Trp531 desde el núcleo de la membrana hidrofóbica están etiquetadas.

a Transferencias de Western de las fracciones superior, media e inferior del ensayo de flotación de liposomas. El marcador de peso molecular de proteína y el marcador de control de carga de eE2 están marcados como L y M, respectivamente. El ensayo de flotación se realizó en tres experimentos independientes y se presenta un ensayo. Cada experimento mostró la misma tendencia; es decir, no hay flotación de E2core+stem con y sin tCD81-LEL a pH bajo mientras que un marcado aumento en la señal en presencia de tCD81-LEL para eE2 y menos mejora con eE2+stem. Para obtener datos de fuente de gel, consulte la Fig. 3 complementaria. b Cuantificación de la transferencia Western de la fracción superior con unidades arbitrarias.

Aquí describimos las regiones de HCV E2 necesarias para la unión de CD81 y la regulación del bucle de unión de CD81 para la asociación de membranas, lo que brinda información mecánica única sobre la entrada de HCV. Aunque el bucle de unión a CD81 de E2 está implicado en la unión a la membrana, el bucle es necesario pero insuficiente para la unión a la membrana. La región N-terminal que linda con el bucle de unión a CD81 en la forma no unida también es necesaria para la unión a la membrana. Esta región N-terminal, que incluye el AS412 y la capa frontal, forman el sitio de unión a CD81, que es el sitio principal de la neutralización mediada por anticuerpos que afecta la unión a la membrana a través de Ile422. Por lo tanto, inferimos que este mecanismo está finamente ajustado en lugar de ser solo una suma de sus partes.

Aquí mostramos la estructura del fragmento E2core+stem unido al Fab 2A12 no neutralizante determinado con una resolución de 2,5 Å. Las estructuras de E2core+stem, E2core, eE2 y ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL complex presentan conocimientos mecánicos únicos durante las primeras etapas de la infección y producen un modelo para los cambios que ocurren durante la unión al receptor y la acidificación endosomal (Fig. 6). La región E2core contiene el dominio globular plegado. El AS412 y la capa frontal son los determinantes críticos para el posicionamiento adecuado del bucle de unión a CD81 y la interacción de CD81. En ausencia de CD81, Ile422 de la capa frontal mantiene el bucle de unión de CD81 en la posición retraída. Tanto E2core como E2core+stem no pudieron unirse a hCD81 in vitro, lo que demuestra la importancia de la región N-terminal (384-459) en la unión del receptor. El VHC, al igual que el virus de la leucosis del sarcoma aviar (ASLV), utiliza un método híbrido de unión a la membrana, que requiere un receptor celular y un pH bajo24. En estas condiciones, E2 sufre dos cambios conformacionales: la capa frontal interactúa con CD81, plegando la región AS412 alrededor de CD81, y luego un bucle interno (bucle de unión a CD81) se extiende hacia afuera del núcleo (Fig. 7a). Dos residuos hidrofóbicos invariantes (Tyr529 y Trp531) en la punta del bucle de unión a CD81 se extienden hacia el huésped y se insertan en la membrana. La eliminación de la capa frontal E2 elimina la interacción de CD81 y libera el bucle de unión de CD81 (Fig. 7b). Sin embargo, el vástago E2core+ era incapaz de unirse a la membrana, lo que sugiere que el bucle de unión a CD81 solo es insuficiente para la unión a la membrana y requiere la capa frontal para una orientación adecuada (Fig. 6). En total, estas cuatro estructuras proporcionan una imagen mecánica de la flexibilidad del bucle de unión a CD81, la función reguladora de la región N-terminal y una comprensión detallada del proceso de entrada viral.

a En presencia de CD81 y pH bajo, la capa frontal se envuelve alrededor de CD81 y luego el bucle de unión a CD81 se extiende hacia la membrana huésped. b La eliminación de la capa frontal de E2 da como resultado la liberación del bucle de unión a CD81, que no se une a CD81 incluso a pH bajo y pierde la capacidad de interactuar con las membranas.

Todos los virus de la envoltura interactúan y se fusionan con las membranas celulares para llevar el genoma viral a la célula. Modelado del complejo E2/tCD81-LEL en la estructura de longitud completa de CD81 (ID de PDB: 5TCX25) Tyr529 y Trp531 están ubicados en la punta del bucle de unión de CD81 que se extiende hacia la bicapa (Fig. 5). Estos residuos son invariables por todos los genotipos principales y son necesarios para la unión de CD81 y la entrada viral26,27. La superposición de la estructura E2core+stem en el complejo eE2/CD81 de longitud completa aleja a Tyr529 y Trp531 de la hoja externa de la membrana a distancias de más de 35 Å y 31 Å de una capa idealizada de fosfatidil carbonilo, respectivamente (Fig. 5 ). La región N-terminal de E2 puede ayudar a orientar el bucle de unión a CD81 hacia la membrana. El modelo de la Fig. 5 utiliza una bicapa idealizada. Sin embargo, la flexibilidad del bucle de unión a CD81 puede ser ventajosa durante la infección por VHC, donde la curvatura de la membrana huésped en el endosoma y la presencia de otros factores (es decir, E1, OCLN y/o CLDN) pueden requerir flexibilidad del bucle para la inserción de la membrana. .

Las proteínas de fusión de la membrana viral se organizan en tres clases (I, II y III) según criterios estructurales con cuatro mecanismos de activación de la fusión24. Actualmente, la proteína de fusión del VHC no ha sido identificada de manera concluyente, y mucho menos clasificada. Se propone que la glicoproteína E1 del VHC sea la subunidad fusogénica del heterodímero E1E2 porque contiene un péptido de fusión putativo28,29. Sin embargo, el bucle de unión a CD81 de E2 tiene propiedades de unión a la membrana y E2 contiene un pliegue en sándwich beta similar a IgG similar a las proteínas de fusión de tipo II24,30. Para complicar aún más la clasificación, se requieren E1 y E2 para una fusión eficiente de virus/huésped, una característica que no se atribuye a ninguna clase. Lo más probable es que el bucle de unión a CD81 esté incrustado en la membrana objetivo y ayude en el proceso de fusión. Todas las proteínas virales fusogénicas son triméricas, sin embargo, no se ha encontrado evidencia de un trímero E2, aunque la hélice TM o E1 pueden afectar la oligomerización. Recientemente se publicó21 la estructura cryoEM de la glicoproteína E1E2 en complejo con tres Fab neutralizantes, que contiene una sola copia del heterodímero E1E2. De manera similar, la inclusión del tallo no produjo trímeros en la estructura del tallo eE2+, aunque esto podría deberse al Fab 2A12, que interactúa en el extremo carboxilo de la proteína E2. Se justifica un estudio adicional para arrojar información sobre el proceso de fusión del VHC.

Se ha demostrado que SR-BI y CD81 interactúan directamente con E2 después de la unión inicial a la célula susceptible. SR-BI se une a través del N-terminal HVR1, mientras que CD81 se une a la proteína E2 a través de una región discontinua que incluye AS412, AS432, el bucle de unión a CD81 y la capa posterior6,16. Sin embargo, el mecanismo molecular de la interacción de SR-BI con E2 sigue siendo oscuro. CD81 con un activador de pH bajo puede ser suficiente para inducir cambios conformacionales. Existe la posibilidad de que SR-BI sea eficaz para inducir cambios conformacionales de una manera dependiente del aislado de VHC31,32.

Usar el receptor secundario, CD81, para la fusión es ventajoso para el virus y consistente con observaciones previas13. Mientras que E2 y CD81-LEL formaron un complejo a pH neutro y pueden hacerlo en la superficie celular, la estabilidad y la homogeneidad del complejo aumentan a pH bajo, en consonancia con la acidificación endosómica. tCD81-LEL adopta una conformación abierta en la que la hélice D está desenrollada, mientras que el CD81 humano se ha observado con mayor frecuencia en la conformación cerrada, también se han descrito conformaciones intermedias y abiertas33. La estructura E2/tCD81-LEL es solo una instantánea del complejo después de la acidificación y antes de cualquier cambio conformacional inducido por la fusión. Al igual que con la descripción de otras proteínas de fusión virales, se necesitan estudios estructurales y mecánicos adicionales para describir adecuadamente el mecanismo de fusión del VHC.

Las HVR de E2 incluyen una proporción sustancial de variantes de secuencia del VHC. Estas regiones son un modo de evasión de anticuerpos neutralizantes. En los pacientes, el HVR1 cambia rápidamente debido a la deriva antigénica impulsada por anticuerpos. Los anticuerpos ampliamente neutralizantes se dirigen contra los epítopos conformacionales conservados de HCV E2 que compiten con el sitio de unión a CD81. El bucle de unión a CD81 está expuesto en la superficie y está protegido de la neutralización mediada por anticuerpos mediante ofuscación conformacional. La identificación del bucle de unión a CD81 en la inserción de la membrana proporciona un objetivo para el diseño de vacunas contra el VHC. La conservación relativamente alta de la secuencia del bucle de unión a CD81 entre diferentes genotipos del VHC y la observación de que los bucles de unión a la membrana de otros virus, incluidos el VIH34, el Ébola35,36,37, la influenza38 y el dengue39, son objetivos importantes para las vacunas y los anticuerpos neutralizantes sugiere que el CD81 El bucle de unión del VHC puede ser un objetivo terapéutico potencial. La información obtenida de estas estructuras cristalinas atómicas podría ser útil en el desarrollo de diseños de vacunas profilácticas contra el VHC.

Los fragmentos J6 E2 del aislado VHC (E2core+residuos de tallo 456–713, eE2+residuos de tallo 384–713 y eE2 residuo 384–656) y CD81-LEL (residuos 112–202 de humano y tamarin) se expresaron en HEK293T GnTI( –) células (ATCC, CRL-3022) y purificadas como se ha descrito anteriormente40. En resumen, un vector lentiviral contiene un promotor de CMV, una secuencia de señal de prolactina, un fragmento J6 E2 como se indicó anteriormente y un sitio de escisión de HRV3C seguido de proteínas A C-terminales y etiquetas Flag. Las células HEK293T GnTI(-) de expresión estable se produjeron mediante transducción lentiviral. A continuación, las células se cultivaron en un biorreactor de células adherentes (Cesco Bioengineering) para el crecimiento a largo plazo y la producción de proteínas. El medio sobrenadante se recogió cada 2 días y se purificó mediante cromatografía de afinidad con IgG seguida de digestión en columna con proteasa HRV3C. La proteína se purificó a alta calidad mediante cromatografía sustractiva sobre columnas GST y Q seguida de cromatografía de exclusión por tamaño con una columna Superdex200 (Cytiva Life Sciences). El rendimiento final de cada proteína fue ~5–10 mg/L de sobrenadante.

El protocolo fue adaptado de un estudio previo16. En resumen, la línea celular de hibridoma 2A12 de ratón se cultivó en el matraz de biorreactor CELLine Classic (Sigma-Aldrich). Se inocularon 6 ml de 6 × 106 células en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) con FBS bajo en IgG al 15 % y HEPES 10 mM pH 7,5 (medio de cultivo) en la capa interna del matraz. La membrana superior se complementó con 350 ml de IMDM con FBS bajo en IgG al 1 % y HEPES 10 mM pH 7,5 (medio nutritivo). Una vez que la confluencia celular alcanzó 6 × 108, se recogieron los medios de cultivo y se centrifugaron a 1000 rpm durante 20 min. El medio 2A12 sobrenadante se purificó adicionalmente a través de la columna de proteína G. Antes de la digestión con papaína para producir 2A12 Fab, el anticuerpo 2A12 purificado se dializó en fosfato de sodio 20 mM pH 7,0 y EDTA 10 mM, y se añadió cisteína-HCl hasta una concentración final de 20 mM y el pH se ajustó a 7,0. Se usaron aproximadamente 100 μL de papaína en perlas de agar inmovilizadas (Thermo Fisher Scientific) para 20 mg de anticuerpo 2A12 y se logró una digestión del 100 % mediante la incubación a 22 °C durante la noche por inversión suave. La reacción de digestión se detuvo eliminando la papaína inmovilizada mediante centrifugación a 4200 × g a 4 °C durante 20 min. El Fab 2A12 purificado se logró mediante una purificación en dos pasos mediante una columna de proteína A y una columna de proteína G. Se usaron HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM y glicerol al 5 % en la purificación mientras que para la columna de proteína G se eluyó Fab 2A12 con TFA al 0,05 % que se neutralizó inmediatamente con Tris 1 M pH 8,0. El Fab 2A12 se desalinizó en Tris 20 mM pH 8,0 para uso posterior y almacenamiento a largo plazo.

E2core+stem (residuos 456–713) se reconstituyó con 2A12 Fab en una proporción molar de 1:1,2 (p/p) y se le añadió hCD81-LEL en una proporción molar de 1:1,3. El complejo se incubó durante la noche a 4 °C. El complejo se purificó en citrato de sodio 20 mM pH 4,5, tampón de NaCl 100 mM mediante cromatografía de exclusión por tamaño en columna Superdex200 (Cytiva Life Sciences). El pico principal (Fig. 1 complementaria) se recolectó y se concentró a través de una unidad de filtración ultracentrífuga Amicon con corte de MW de 3 kDa (Millipore) hasta una concentración final de 5 mg/mL. El análisis de los picos de cromatografía de exclusión por tamaño muestra que hCD81-LEL no se une al complejo (Fig. 1B complementaria). El complejo E2core+stem/2A12 Fab se estableció a pequeña escala, con un tamaño de gota de 400 nl, utilizando un sistema de manipulación de líquidos de mosquitos (SPT Labtech) con varias pantallas de cristalización (Hampton Research). Se hicieron crecer cristales de calidad de difracción en pantalla Hampton HR2-139, condición D10; Citrato de sodio tribásico dihidrato 0,2 M, PEG 3350 al 20 % p/v, pH 8,3. Los cristales se congelaron directamente a partir de placas de 96 pocillos usando etilenglicol al 30 % como crioprotector y se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido. Los datos se recopilaron a 0,979 Å en la línea de luz SER-CAT 22-ID en APS, Argonne National Laboratory.

Los cristales E2core+stem (residuos 456–713)−2A12Fab pertenecen al grupo espacial P22121 con parámetros de celda unitaria a = 48,97 Å, b = 125,54 Å yc = 157,32 Å. Las fases moleculares se determinaron mediante PHENIX_phaser41 utilizando la entrada 7MWW de PDB como modelo inicial. La ubicación inequívoca de las cadenas pesada y ligera Fab proporcionó las fases necesarias para extender el mapa para cubrir las coordenadas eE2, utilizando rondas iterativas de construcción de modelos y modificación de densidad por Coot42. Durante cada ciclo de refinamiento iterativo, el modelo fue evaluado para varios parámetros de calidad. El modelo final se construyó con una resolución de 2,45 Å. El modelo E2core+stem contiene los residuos 491–571, 596–653 y 2 N-acetilglucosaminas, mientras que los residuos 456–490, 572–595 y 653–713 están ausentes debido a la flexibilidad. El modelo Fab 2A12 consta de los residuos 1–218 y 1–219 para las cadenas ligera y pesada, respectivamente. El modelo se refinó a Rwork 0,203 y Rfree 0,231 con el 96,12 % de los residuos en las regiones favorecidas, el 3,53 % permitido y el 0,35 % de regiones atípicas del diagrama de Ramachandran calculado con el software MolProbity43. El CC1/2 general (coeficiente de correlación de Pearson) de los datos procesados es 0,991 y el CC1/2 en la cubierta exterior es 0,571. La integridad general de los datos es del 97,8 % con un 99,1 % en la capa exterior con redundancia 4 y 4,2, respectivamente. Las estadísticas de procesamiento y refinamiento de datos se dan en la Tabla 1.

El ensayo de flotación de liposomas se adaptó con ligeras modificaciones16. 15 μg de un fragmento J6 E2 [eE2core+stem (residuos 456–713), eE2 (residuos 384–656), eE2+stem (residuos 384–713) o ΔHVR1 eE2 (406–656)], se mezcló con 18 μg de CD81-LEL (un exceso molar de seis veces de CD81-LEL) y volumen ajustado a 60 μL con citrato de sodio 20 mM pH 5,0 y NaCl 100 mM. Las muestras se incubaron durante la noche a 4 °C en hielo. Se agregaron 54 μL de PC de soya de 200 nm: liposomas de colesterol (proporción molar 70:30) de Encapsula NanoSciences (stock 10 mM o 8 μg/μL) (CPC-610) y se incubaron a 37 °C durante 1 h con golpecitos suaves. en ciertos intervalos. Después de la incubación, se agregaron 67 μL de KCl 3 M a una concentración final de KCl 1 M y se incubó a 37 °C durante 15 min para minimizar la asociación electrostática inespecífica entre proteínas y lípidos. Luego se añadió sacarosa al 67 % (p/v) en citrato de sodio 20 mM pH 5,0 y tampón de NaCl 100 mM hasta una concentración final del 40 % en un volumen final de 500 μL. La muestra se mezcló suavemente con una pipeta de 1 ml y luego se colocó bajo un gradiente escalonado de 0,1 ml de sacarosa al 5 % y 11,4 ml de sacarosa al 25 % (p/v) en un tubo de centrífuga ultratransparente de pared delgada con la parte superior abierta (Beckman Coulter, 344060). ). Los gradientes se centrifugaron a 281 000 × g durante 150 min a 4 °C en un rotor oscilante SW40 Ti (ultracentrífuga Beckman Coulter Optima XL-100K). Después de la centrifugación, cada gradiente se fraccionó, de arriba hacia abajo, en 20 fracciones de 600 μL. A continuación, las fracciones superiores o intermedias se concentraron en unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-0,5 ml de corte de MW de 10 kDa (Millipore) a una velocidad de 10.000 × g hasta un volumen final de 150 μl. Se agregaron 15 μL de colorante reductor 10x SDS-PAGE a cada una de estas muestras para el análisis de transferencia Western.

Todas las fracciones se diluyeron con tampón de muestra reductor SDS-PAGE 10x hasta una concentración final de 1x y se desnaturalizaron a 95 °C durante 5 min. Se corrieron 50 μL de cada muestra junto con el marcador eE2 y un marcador de peso molecular de proteína Odyssey (Li-Cor) (L) en geles prefabricados Bis-Tris al 4–20 % (Bio-Rad). A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF utilizando un sistema de transferencia Turbo Trans-Blot (Bio-Rad). La membrana se bloqueó con Intercept (PBS) Blocking Buffer (Li-Cor) durante 1 hora a 37 °C y luego se incubó la mancha con una dilución 1:500 de un ratón 8A6 purificado durante la noche a 4 °C. La dilución del anticuerpo primario se preparó en tampón de bloqueo Odyssey en PBS con Tween 20 al 0,05 % (Sigma-Aldrich). El anticuerpo secundario, IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (Li-Cor, 926-32210), se utilizó a una dilución de 1:10.000. El Western blot se escaneó usando el software Li-Cor Odyssey (v.3.0).

El anticuerpo monoclonal 8A6 se generó en el laboratorio del Dr. Arash Grakoui (número de protocolo IACUC YER-2002369-070816GN, Facultad de Medicina de la Universidad de Emory, Atlanta, Georgia, EE. UU.). Se inmunizaron ratones BALB/c por vía intraperitoneal con 50 µg de eE2 en adyuvante completo de Freund (solo la primera inmunización) o adyuvante incompleto de Freund cada dos semanas durante 8 semanas. Se administró una inmunización final con 50 µg de eE2 por vía intravenosa cuatro días antes de la recolección de esplenocitos. Los hibridomas se generaron utilizando una línea celular de mieloma de ratón sensible a HAT clonada como pareja de fusión. Los hibridomas en proliferación se examinaron en cuanto a su capacidad para unirse a eE2 mediante ELISA, momento en el que se identificó positivamente 8A6.

Las células de hibridoma se expandieron en IMDM (Hyclone) que contenía un 10 % de FCS bajo en IgG (Hyclone) y gentamicina (Gibco). El sobrenadante se recolectó y aclaró por centrifugación a 4000 × g durante 10 min a 4 °C. Los anticuerpos monoclonales se purificaron mediante cromatografía en columna de afinidad con proteína G y se concentraron usando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 (Millipore).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan este estudio están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Las coordenadas y los factores de estructura generados en este estudio se han depositado en Protein Data Bank (PDB) con el código de acceso 8DK6 (E2 core+stem/2A12 Fab). Las estructuras publicadas anteriormente utilizadas en este estudio se pueden encontrar en los códigos de acceso 4WEB (núcleo E2), 7MWW (estructura eE2), 7MWX (ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL) y 5TCX (CD81 de longitud completa).

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Nos gustaría agradecer a M. Paskel por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por los programas de investigación intramuros del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (JM) y las subvenciones de NIH R01AI136533, R01AI124680, R01AI126890 y U19AI159819 a AG y ORIP/OD P51OD011132 (anteriormente NCRR P51RR000165) a Emory National Primate Research Centro (AG). El uso de la fuente de fotones avanzada fue respaldado por el Departamento de Energía de EE. UU., Oficina de Ciencias, Oficina de Ciencias Energéticas Básicas, bajo el Contrato No. W-31-109-Eng-38 (SER-CAT).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

Estos autores contribuyeron igualmente: Ashish Kumar, Tiana C. Rohe.

Sección de Virología Estructural, Laboratorio de Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 20892, EE. UU.

Ashish Kumar, Tiana C. Rohe, Altaira D. Dearborn y Joseph Marcotrigiano

Centro Nacional de Investigación de Primates de Emory, División de Microbiología e Inmunología, Centro de Vacunas de Emory, Facultad de Medicina de la Universidad de Emory, Atlanta, GA, 30329, EE. UU.

Elizabeth J. Elrod y Arash Grakoui

Centro de Biotecnología y Medicina Avanzadas, Rutgers, Universidad Estatal de Nueva Jersey, Piscataway, NJ, 08854, EE. UU.

Abdul G Khan

Rama de Tecnología de Investigación, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, Hamilton, MT, 59840, EE. UU.

ryan kissinger

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Correspondencia a José Marcotrigiano.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

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Reimpresiones y permisos

Kumar, A., Rohe, TC, Elrod, EJ et al. Se requieren regiones del virus de la hepatitis C E2 para la asociación con la membrana. Nat Comun 14, 433 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36183-y

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Recibido: 08 Agosto 2022

Aceptado: 19 de enero de 2023

Publicado: 26 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36183-y

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