Funciones potenciales de las acil homoserina lactonas (AHL) en la supervivencia de las bacterias nitrificantes en determinadas circunstancias adversas

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 705 (2023) Citar este artículo

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Los roles potenciales de la detección de quórum (QS) en la actividad y la ecología de las bacterias nitrificantes, particularmente en circunstancias adversas, rara vez se han informado. En este documento, ocho reactores por lotes de secuenciación de nitrificación a escala de laboratorio, con o sin adición de acil homoserina lactonas (AHL) se operaron en circunstancias adversas, respectivamente. Los resultados indicaron que la introducción de AHL mejoró significativamente la eficiencia de eliminación de nitrógeno en presencia de inhibidores de la nitrificación (diciandiamida, DCD), aceleró el grupo de baja temperatura (10 °C) a la etapa estable y mejoró la eficiencia de utilización de AHL en estos dos grupos El análisis comunitario y qPCR confirmaron además que los AHL aumentaron significativamente la abundancia de bacterias nitrificantes en el grupo de baja temperatura y el grupo DCD, especialmente AOB. Sin embargo, para condiciones normales (28 °C, pH = 8) o nivel de pH bajo (5,5), las AHL no tuvieron un efecto significativo. El análisis de correspondencia canónica mostró que las bacterias nitrificantes respondieron positivamente a los AHL, lo que indica que agregar AHL fue una estrategia efectiva para regular el proceso de nitrificación. Sin embargo, en condiciones ácidas, el efecto de este mecanismo regulador no fue significativo, lo que indica que la influencia del pH en el sistema fue mayor que la de los AHL. Este estudio demostró que los AHL exógenos podrían mejorar la competitividad de las bacterias nitrificantes para utilizar más recursos y ocupar espacio en algunas condiciones ambientales adversas.

Las bacterias nitrificantes son tipos de bacterias aeróbicas autótrofas relativamente débiles, con un ciclo de generación más largo y mayores requisitos en el entorno de supervivencia. Algunos factores adversos pueden influir en la actividad de las bacterias nitrificantes, como la temperatura baja (< 15 °C), el pH, el tiempo de retención hidráulica (HRT) corto, el amoníaco libre (FA) y el ácido nitroso libre (FNA)1,2. Además, puede haber algunas trazas de inhibidores de la nitrificación (NI) en el afluente de la planta de tratamiento de aguas residuales, como la diciandiamida (DCD, un inhibidor de la oxidación del amoníaco común que se informa con frecuencia en las plantas de tratamiento de aguas residuales municipales reales)3, que puede inhibir significativamente la actividad de las bacterias nitrificantes. Algunos cambios en los factores ambientales también tienen un impacto significativo en el proceso de nitrificación, y el sistema tardará mucho tiempo en volver a funcionar de manera estable. Como consecuencia, es de gran importancia práctica explorar la rápida recuperación de los efectos adversos en el sistema de nitrificación.

La detección de quórum (QS) regula la relación ecológica de la flora y el comportamiento fisiológico liberando y detectando la concentración de la molécula de señal para inducir la expresión de genes relacionados en las bacterias y lograr las funciones fisiológicas y los mecanismos reguladores que las bacterias individuales no pueden realizar, como como la formación de biopelículas y la producción de metabolitos secundarios, etc.4,5,6. Las bacterias dependen de las actividades fisiológicas anteriores para sobrevivir bajo estrés ambiental7. Las N-acil homoserina lactonas (AHL), una de las sustancias de señalización de QS, se han caracterizado bien en bacterias Gram-negativas8,9. En la actualidad, muchas bacterias nitrificantes, tanto en cultivos puros como mixtos, tienen efecto QS, y su correlación con QS ha sido confirmada mediante tecnología de secuenciación de genes10,11. Los cultivos puros de muchas soluciones sobrenadantes de bacterias oxidantes de amoníaco (AOB) podrían producir AHL, como Nitrosomonas europaea y Nitrosospira multiformis11,12. También se detectaron AHL en biorreactores de membrana (MBR), biopelículas nitrificantes y biopelículas nitrificantes autotróficas13,14,15. Aunque algunos AOB no producen AHL (con el gen del receptor AHL, sin el gen de la AHL sintasa), pueden utilizar AHL12 exógeno. Recientemente se ha descubierto que Nitrosospira multiformis, otro organismo modelo AOB, tiene un regulador y sintasa de señalización QS de tipo LuxI/R, que puede producir moléculas de señalización C4-HSL y 3-o-C14-HSL16. Yu et al. descubrió que mejorar la extinción del quórum para inhibir QS en MBR reduciría el efecto de nitrificación, lo que demuestra indirectamente la importancia de QS para la nitrificación17. Estos estudios mostraron una fuerte relación entre las bacterias nitrificantes y QS. Por lo tanto, es razonable sospechar que QS, que es muy importante para que las bacterias sobrevivan bajo estrés ambiental, puede mejorar la actividad de las bacterias nitrificantes y la eliminación de nitrógeno bajo condiciones de estrés.

Para evaluar las posibles funciones reguladoras de los AHL en el comportamiento de las bacterias y las características de las bacterias nitrificantes en determinadas condiciones adversas, como baja temperatura, bajo nivel de pH y presencia de DCD, se realizaron ocho pruebas por lotes con o sin adición de AHL. Los tipos de moléculas señalizadoras de AHL añadidas fueron C6-HSL y C8-HSL, respectivamente, que fueron dominantes en el sistema según los resultados de la detección. Se examinaron la capacidad de eliminación de nitrógeno y la actividad QS dosificados con AHL, y se analizó el número de AOB& bacterias oxidantes de nitrito (NOB), así como la comunidad y diversidad bacteriana, por lo que se propuso el posible mecanismo de señales exógenas en los microorganismos nitrificantes. El objetivo de este estudio es investigar el efecto de los AHL en la eliminación de nitrógeno y, finalmente, proponer una estrategia para mejorar la actividad de las bacterias nitrificantes en algunas condiciones estresantes.

Las moléculas de señalización utilizadas en este estudio (N-hexanoil-l-homoserina lactona (C6-HSL) y N-octanoil-l-homoserina lactona (C8-HSL)) se adquirieron de Sigma-Aldrich (China). Los AHL se disolvieron en metanol con una concentración final de 1 g/l como soluciones madre y se añadió ácido fórmico a una concentración del 0,1 % (v/v). DCD se adquirió de Sigma-Aldrich.

Se utilizó un reactor por lotes de secuenciación completamente automático (SBR) con un volumen efectivo de 6 L para la preparación del inóculo de bacterias nitrificantes. El tiempo de ciclo del reactor fue de 8 h comprendiendo las siguientes fases: 30 min alimentación, 4 h aireación, 2 h anóxica, 1 h sedimentación y 30 min decantación. El lodo de siembra se obtuvo del lodo de retorno del tanque de sedimentación en la planta de tratamiento de aguas residuales de Wuhan. Los detalles de la solución de stock de alimentación sintética se muestran en la Tabla complementaria S1. Las concentraciones de NH4+–N fueron inicialmente de 25 mg/L, aumentaron a 50 mg/L después de dos semanas de cultivo y se mantuvieron durante dos semanas, para luego elevarse a la concentración final de 100 mg/L. El nivel de pH se mantuvo en 8,0 con Na2CO3. La concentración de oxígeno disuelto (OD) se varió entre 2,0 y 4,0 mg/L (aireación) utilizando un medidor de flujo de aire. La temperatura estuvo en el rango de 28 °C con un calentador termostático (GDH-4006, SCIENTZ). Las bacterias nitrificantes se recolectaron cuando se oxidó aproximadamente el 65% del amonio y luego se detectó AHL en el sobrenadante.

Ocho SBR automáticos de 1000 ml que se llenan con 300 ml de solución madre de alimentación sintética y 300 ml de inóculo de bacterias nitrificantes, divididos en promedio en cuatro grupos, grupo normal (N-BR y N-ER), grupo ácido (A-BR y A-ER) , grupo DCD (D-BR y D-ER) y grupo de baja temperatura (L-BR y L-ER). El matraz lleno con mezclas de AHL 1 μM (mezcla de volumen iso C6-HSL y C8-HSL) era un reactor experimental (ER), y el matraz sin AHL era un reactor en blanco (BR). Los reactores funcionan de la misma manera que en "Preparación de inóculo". Los detalles de cuatro grupos se muestran en la Tabla complementaria S2. La concentración de NH4+–N afluente es de 100 mg/L. Los tipos agregados de AHL se confirmaron de acuerdo con los tipos dominantes en los reactores, y la concentración agregada de AHL se determinó de acuerdo con la literatura relevante10,17. La mezcla de AHL se añadió al matraz una vez al día durante la fase de alimentación. Todos los matraces se operaron como se menciona en 2.2 durante 20 días.

El nitrógeno amoniacal (NH4+–N), el nitrógeno nitrito (NO2–N) y el nitrógeno nítrico (NO3–N) se midieron de acuerdo con métodos estándar cada dos días (APHA, 2005), y la eficiencia de eliminación de cada índice se calculó de acuerdo con la ecuación . (1). Los sólidos suspendidos en licor mixto (MLSS) se definieron como secado a 105 °C durante 12 h una vez cada dos días. El OD y el pH se midieron con un analizador de calidad del agua multiparamétrico (HQ30D, HACH, EE. UU.). Las concentraciones de amoníaco libre (FA) y ácido nitroso libre (FNA) se calcularon de acuerdo con la ecuación. (2) y (3). Se aplicó el software SPSS (versión 19.0) para realizar la prueba T para probar las diferencias entre varias muestras, y se consideró que las diferencias eran estadísticamente significativas cuando p < 0,05.

La AHL en el inóculo de bacterias nitrificantes se extrajo de los sobrenadantes y se concentró mediante extracción en fase sólida (SPE) utilizando columnas C18 (Agilent, América) según Li et al.18. La concentración de AHL se analizó mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) equipada con una fuente de ionización por electropulverización (ESI). Los métodos detallados para AHL estándar estaban de acuerdo con nuestro estudio anterior19.

Para evaluar la degradación de AHL en el sistema, se retiraron 500 ml de lodo activado de N-BR y A-BR y se inactivaron en los vasos de precipitados, por separado. Luego se agregaron 1 μM de C6-HSL y C8-HSL a los vasos de precipitados. La mezcla se incubó en un agitador a 28 °C, 120 rpm durante 24 h. Retire periódicamente la mezcla de los vasos de precipitados para medir la concentración de AHL.

La extracción de ADN se realizó con un kit DNeasy PowerSoil Pro (QIAGEN, Alemania). Las concentraciones de ácido nucleico se determinaron mediante espectrofotómetro (NanoDrop). La secuenciación del ADNr 16S se llevó a cabo en el sistema Illumina HiSeq 2500 de Sangon Biotech (Shanghai, China). Las secuencias de los cebadores fueron 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) y 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) con una concentración final de 5 μmol/L.

La extracción de ADN total se llevó a cabo como se menciona en "Análisis de secuenciación de alto rendimiento para la composición de la comunidad". Los cebadores utilizados para amplificar el gen 16s rRNA, el gen amoA y el gen nxr se muestran en la Tabla complementaria S3. El establecimiento del procedimiento de amplificación y la formulación del sistema de reacción se realizaron de acuerdo con las instrucciones PerfectStart Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, China). El volumen final de cada reacción de PCR fue de 20 μL, que contenía lo siguiente: mezcla maestra de PCR SYBR Green (Applied Biosystems, EE. UU.) 12,5 μL, el ADN molde (el ADN extraído se diluyó 100 veces) 3 μL, cada cebador 1 μL, así como ddH2O 2,5 μL. Luego, la amplificación por PCR se realizó mediante un sistema de detección de secuencias (ABI Prism 7500). qPCR utilizó un método de dos pasos: 30 s de desnaturalización a 94 °C, 40 ciclos de 5 s a 94 °C y 60 °C durante 30 s. El análisis de la curva de fusión se realizó al final de todas las corridas de qPCR para determinar la especificidad de los productos amplificados.

La concentración inicial de NH4+–N fue de alrededor de 99,08 ± 0,52 mg/L. La tendencia de eliminación de amoníaco a lo largo del tiempo fue bastante similar en todas las pruebas excepto en N-BR y N-ER, en las que las eficiencias de eliminación fueron ligeramente más rápidas que en otros grupos en los primeros 2 días (Fig. 1a). Esto fue seguido por un sorprendente aumento de la eficiencia de eliminación de amoníaco en todas las pruebas. La eficiencia de eliminación de NH4+–N en N-ER y L-ER fue de aproximadamente 99 % al final del experimento, que no aumentó significativamente en comparación con N-BR y L-BR (p = 0,055), excepto que el tiempo de entrada la etapa estable fue anterior a la de BR, lo que indica que la dependencia de AOB en QS no era fuerte en dicho entorno. Cultivando en un entorno desfavorable durante 20 días, la eficiencia de eliminación de NH4+–N en el grupo DCD y el grupo ácido fue significativamente menor que en el grupo normal. La eficiencia de remoción de NH4+–N entre reactores de ácido no mostró diferencias significativas (p = 0.649), las cuales estuvieron alrededor de 47% para BR y 48% para ER al final del experimento, respectivamente. La menor eficiencia de conversión de amoníaco puede atribuirse al efecto de FNA. La concentración de FNA en el grupo ácido estuvo en el rango de 0,15 a 0,64, superior al umbral de inhibición de 0,02 mg/L24, mientras que FNA en otros grupos fue inferior al umbral de inhibición (Fig. 2a). Sin embargo, para la prueba en el grupo DCD, se presentó un cambio en la remoción de NH4+–N en los reactores con adición de AHLs exógenos (p < 0.05), con una eficiencia final de remoción de NH4+–N de 59% (BR) y 72% (ER), respectivamente.

El rendimiento del lodo activado durante el período de operación de cuatro grupos. N grupo normal, A grupo ácido, D grupo DCD, L grupo de baja temperatura, reactor blanco BR, reactor experimental ER. Las barras de error se definen como el error estándar de la media (n = 3, réplicas biológicas).

Niveles de FA y FNA de cuatro grupos de lodos activados durante la operación. N grupo normal, A grupo ácido, D grupo DCD, L grupo de baja temperatura, reactor blanco BR, reactor experimental ER. Las barras de error se definen como el error estándar de la media (n = 3, réplicas biológicas).

El efecto de la adición de AHL en NO2-N y NO3-N también se examinó en todas las pruebas por lotes (Fig. 1b, c). Obviamente, la formación de NO2–N y NO3–N ocurrió con una disminución de NH4+–N. Debido a la menor concentración de FA (< 6 mg/L) y concentración de FNA (< 0,02 mg/L) en el grupo normal (Fig. 2a,b), el nivel de NO2-N disminuyó acompañado por un aumento pronunciado del nivel de NO3-N. Al final del experimento, la concentración de NO3–N fue de alrededor de 86 mg/L. Estos resultados fueron consistentes con la eficiencia de eliminación de NH4+–N. Algunos investigadores han demostrado que NOB era menos tolerante a FA y FNA24. Se inhibiría cuando el nivel de FA fuera superior a 6 mg/L o la concentración de FNA fuera superior a 0,02 mg/L. Por lo tanto, el NOB en el grupo normal no fue inhibido por FA y FNA, y casi todo el nitrito se convirtió en nitrato. Los cambios en la concentración de NO2–N y NO3–N en los reactores del grupo ácido dos fueron similares y se estabilizaron en 27–29 mg/L y 5–7 mg/L aproximadamente, lo que indica que la actividad de NOB fue inhibida. El NO2–N y el NO3–N mostraron diferencias significativas en D-BR y D-ER. Las concentraciones del efluente NO2–N y NO3–N fueron 39,3 ± 2,21 y 6,51 ± 1,95 mg/L en D-BR, y 17,52 ± 2,31 y 40,49 ± 1,79 mg/L en D-ER. Estos resultados indicaron que la adición de AHL alivió efectivamente la inhibición de DCD en NOB y promovió la transformación de NO2-N. En el grupo de baja temperatura, la acumulación de NO2–N ocurrió en ambos reactores al comienzo del experimento y luego se transformó gradualmente en NO3–N, mientras que L-ER alivió la acumulación de NO2–N antes que L-BR. Durante este proceso, las concentraciones de FNA y FA alcanzan el nivel por debajo del umbral de inhibición de NOB, lo que conduce a una concentración más baja de NO2-N en L-ER. Además, la diferencia significativa de los niveles de NO2–N y NO3–N entre el grupo DCD y el grupo de baja temperatura podría atribuirse a las actividades AOB como se mencionó anteriormente.

Se detectaron cinco tipos de AHL en las aguas residuales iniciales, a saber, C4-HSL, C6-HSL, C7-HSL, C8-HSL y 3-oxo-C12-HSL. Entre ellos, C6-HSL y C8-HSL fueron dominantes en el sistema y se ha confirmado que están ampliamente presentes en el sistema de bacterias nitrificantes y otras instalaciones de tratamiento de agua, por lo que este experimento estudió principalmente estos dos AHL12,20. Las concentraciones de C6-HSL y C8-HSL se mantuvieron estables durante la prueba, oscilando entre 13,34 y 34,85 nM en todas las condiciones del lote. Para determinar la utilización de AHL por bacterias en diferentes condiciones, la degradación de AHL en 24 h se detectó en primer lugar como control en blanco. Como se puede ver en la Fig. 3a, b, la eficiencia de degradación de C6-HSL fue significativamente menor que la de C8-HSL en las mismas condiciones, y el nivel de AHL en condiciones ácidas fue significativamente mayor. Al final del experimento, C6-HSL se degradó 53 % (pH 8,0) y 38 % (pH 5,5), y C8-HSL fue 56 % (pH 8,0) y 46 % (pH 5,5). Dado que el lodo activado se ha inactivado, la degradación de las moléculas de señal puede deberse a la adsorción del lodo activado. Esto es consistente con las investigaciones de Tan et al.21. Además, la diferencia en la eficiencia de degradación entre pH 8,0 y pH 5,5 podría explicarse por la degradación más fácil de AHL en condiciones alcalinas22.

Detección de la degradación y uso de AHL en muestra de sobrenadante de lodo en reactores de cuatro grupos por UPLC-MS/MS. (a) La degradación de AHL en 24 h cuando pH = 8.0; (b) la degradación de AHL en 24 h cuando pH = 5,5; (c) el uso de C6-HSL en cuatro reactores de adición AHL; d: el uso de C8-HSL en cuatro reactores de adición AHL. N grupo normal, A grupo ácido, D grupo DCD, L grupo de baja temperatura, reactor experimental ER. Las barras de error se definen como el error estándar de la media (n = 3, réplicas biológicas).

Después de agregar dos tipos de AHL a diferentes sistemas durante 20 días, la eficiencia de degradación de AHL en el sistema cambió (Fig. 3c, d). Se ignoró la concentración original porque la concentración añadida era mucho mayor que la generada por el sistema (13,34–34,85 nM). En N-ER, la eficiencia de degradación de C6-HSL y C8-HSL cambió a 60% y 62%, con un aumento de 11,7% y 9,7%. La mayor eficiencia de degradación sugirió que parte de la AHL añadida fue utilizada por las bacterias. En el ambiente ácido (pH 5,5), la eficiencia de degradación de C8-HSL aumentó ligeramente del 46 al 50 %, mientras que la eficiencia de degradación de C6-HSL se mantuvo en alrededor del 38 %. Como puede verse a partir de los resultados experimentales, el crecimiento bacteriano se inhibió en condiciones ácidas, lo que resultó en una baja eficiencia de utilización de AHL, lo que indica que la actividad QS de este sistema fue baja. También se detectaron cambios notables en el grupo DCD y el grupo de baja temperatura. Las eficiencias de degradación de dos AHL aumentaron claramente, con 62 % de C6-HSL y 69 % de C8-HSL en D-ER, y 65 % de C6-HSL y 74 % de C8-HSL en L-ER respectivamente, lo que indica más Los AHL fueron utilizados por bacterias. Los resultados anteriores sugirieron que AHL podría estar correlacionado con las actividades de las bacterias nitrificantes, lo cual fue consistente con el resultado del proceso de eliminación de nitrógeno.

Teniendo en cuenta que la adición de AHL alteró significativamente la eficiencia de eliminación de nitrógeno del reactor por lotes, fue necesario analizar el efecto de los AHL exógenos sobre la actividad de las bacterias nitrificantes. Como se muestra en la Fig. 4, la abundancia de AOB y Nitrospira fue consistentemente dominante en todos los grupos. El porcentaje de AOB y Nitrospira en el total de bacterias mostró una ligera tendencia a la baja en el grupo normal después de agregar AHL, AOB del 16,98 % (BR) al 12,03 % (ER), Nitrospira del 11,73 % (BR) al 10,44 % (ER), respectivamente, lo que indica que los AHL no aumentaron la abundancia de bacterias nitrificantes. De manera similar, la adición de AHL obviamente no revirtió la disminución de los números de AOB y Nitrospira a pH 5,5, ya que la abundancia de AOB y NOB fue 4,46% y 1,94% en BR, y 5,09% y 2,04% en ER, respectivamente. Sin embargo, después de agregar 1 μM de AHL, AOB y NOB, la biomasa en DCD y el grupo de baja temperatura aumentó significativamente, especialmente AOB con una proporción que aumentó de 9,4 % (D-BR) y 27,14 % (L-BR) a 11,22 % (D-ER ) y 33,31% (L-ER), respectivamente. Al mismo tiempo, no hubo un aumento significativo en la biomasa total de bacterias en el grupo DCD y de baja temperatura (datos no mostrados). Este claro aumento de AOB se consideró un efecto importante de los AHL en el sistema. Vale la pena señalar que la abundancia de bacterias nitrificantes a bajas temperaturas fue generalmente mayor que la del grupo normal, especialmente AOB, lo que reflejó aún más las diferentes estrategias de regulación de las AHL a temperatura ambiente y baja temperatura. Teniendo en cuenta el rendimiento del reactor, se infirió que los AHL tendían a aumentar la abundancia de bacterias nitrificantes en respuesta a las presiones ambientales a bajas temperaturas.

La relación de abundancia de AOB y NOB con respecto al total de bacterias en cuatro grupos. N grupo normal, A grupo ácido, D grupo DCD, L grupo de baja temperatura, reactor blanco BR, reactor experimental ER.

En la Tabla 1, la alta cobertura de Good de las muestras (más del 98 %) indicó que el resultado representa los componentes microbianos de las muestras de lodo. Se observaron valores más altos de Chao1 y ACE en el reactor experimental de cuatro grupos, lo que significa mayor riqueza. Shannon y Simpson cambiaron las muestras durante el cultivo de bacterias nitrificantes en diferentes ambientes. La diversidad de especies disminuyó significativamente en el grupo ácido, pero aumentó significativamente en los grupos de baja temperatura y DCD. En particular, el índice de diversidad en el reactor de adición AHL fue más alto que el del reactor de control entre 3 grupos (espere el grupo ácido).

La comparación de los perfiles de secuenciación de alto rendimiento de 8 reactores mostró diferencias significativas en las composiciones bacterianas (Fig. 5a). Se identificaron un total de 36 géneros de bacterias en todas las muestras con clasificadores RDP a partir de nuestra secuencia filtrada. Nitrosomonas, Dokdonella, Ns9 maine group, Terrimonas, Tetrasphaera y Thermomonas fueron las bacterias dominantes que representan aproximadamente del 5% al ​​13% (abundancia relativa) de la comunidad de bacterias. Después de 20 días de cultivo con AHL, la abundancia relativa de Nitrosomonas y Nitrospira aumentó en más de un 20 %, en las que Nitrospira obtuvo la mayor abundancia relativa de 53,9 %, 53,8 %, 43,8 % y 28,3 %, respectivamente. Las nitrosomonas se encuentran comúnmente en las plantas de tratamiento de aguas residuales con bajos niveles de amonio. La abundancia relativa más alta para este género generalmente se logró cuando el NH4+–N fue más bajo. Nitrospira es la principal bacteria oxidante de nitritos existente en plantas de tratamiento de aguas residuales y reactores de laboratorio. Los cambios en la abundancia de estas dos bacterias fueron consistentes con los cambios en las eficiencias de degradación del nitrógeno descritos en "Impacto de los AHL en la nitrificación en circunstancias adversas". Vale la pena señalar que la abundancia de estas dos bacterias fue significativamente mayor a baja temperatura que a temperatura normal, de acuerdo con los resultados en "Impacto de la adición de AHL en la abundancia relativa de bacterias nitrificantes". La abundancia del grupo Ns9 maine disminuyó significativamente en todos los grupos experimentales, lo que sugiere que las AHL pueden inhibir este género. La variación significativa de estos géneros podría ser el resultado de la alimentación de AHL, lo que indica que las AHL exógenas podrían ser un factor crítico en la alteración de la comunidad bacteriana.

Composiciones bacterianas y análisis de correspondencia canónica entre los factores ambientales y la comunidad entre 8 reactores. (a) distribuciones de la comunidad bacteriana en el lodo en diferentes reactores; (b) análisis de correspondencia canónica entre los factores ambientales y la comunidad bacteriana. N grupo normal, A grupo ácido, D grupo DCD, L grupo de baja temperatura, reactor blanco BR, reactor experimental ER.

La variación de la comunidad bacteriana, que influye en la calidad del agua y los factores ambientales, como el pH, la temperatura y los inhibidores de la nitrificación, se explicó mediante el análisis de correspondencia canónica (CCA). El diagrama biplot destacó las relaciones entre los factores ambientales y la composición de bacterias con un peso de especie > 5 % durante cuatro procesos de cultivo en la Fig. 5b. La concentración de DCD y NO2–N tuvo el mayor efecto sobre la distribución de la comunidad bacteriana, mientras que la concentración de NH4+–N tuvo el menor efecto, lo que también explica la alta eficiencia de degradación de NH4+–N en las cuatro condiciones de operación, mientras que el NO2–N se acumuló en algunos grupos La mayoría de las bacterias dominantes en el sistema (Dokdonella, Ns9 maine group, Terrimonas, Tetrasphaera y Thermomonas) se correlacionaron significativamente negativamente con el pH, lo que resultó en un tratamiento deficiente del sistema cuando se opera a un pH bajo. Vale la pena señalar que hubo una correlación positiva significativa entre las bacterias nitrificantes y AHL, lo que indica que la adición de AHL puede promover significativamente el proceso de nitrificación. Por lo tanto, los resultados confirmaron que la comunidad de bacterias nitrificantes se vio afectada de manera gradual y significativa durante el período de adición de AHL.

En las instalaciones de tratamiento biológico de aguas residuales, los QS regulan la densidad de bacterias y organizan su comportamiento colectivo, lo que también tiene efectos importantes en el rendimiento del lodo activado, la comunidad microbiana y el reactor. Muchos estudios han confirmado que muchas funciones fisiológicas de las bacterias nitrificantes en WWT están relacionadas con QS basado en AHL10,11,12,13,14,15. La detección de moléculas de señal confirmó aún más esta conclusión. Varios tipos de AHL generados por AOB se habían demostrado en el sobrenadante en estudios previos23. Sin embargo, los informes disponibles sobre las acciones de QS mediada por AHL en bacterias nitrificantes son muy limitados, especialmente las bacterias nitrificantes en condiciones de crecimiento desfavorables. Si QS puede promover la recuperación de la actividad de las bacterias nitrificantes necesita más estudio. Por lo tanto, intentamos estimar el impacto potencial de los AHL en la regulación del comportamiento bacteriano y las características de las bacterias nitrificantes en condiciones adversas. Nuestros datos demostraron una promoción significativa de AHL en bacterias nitrificantes en condiciones inadecuadas. Se ha encontrado el papel positivo del QS mediado por AHLs en presencia de DCD y a bajas temperaturas, bajo las cuales la proporción de AOB y NOB en todas las bacterias aumenta significativamente, mejorando así la eficiencia del sistema en condiciones adversas. Sin embargo, el efecto no fue significativo en condiciones de cultivo normales y en condiciones ácidas.

Los factores ambientales tendrían un impacto profundo en la efectividad de los AHL, lo que afectaría el nivel de QS basado en AHL en el entorno circundante. Cuando el pH no conduce al crecimiento de AOB y NOB, el efecto del pH sobre AOB fue más fuerte que el de AHL sobre AOB, por lo que el efecto de promoción de AHL exógeno no es significativo. La eficiencia de eliminación de NH4+–N y la eficiencia de formación de NO2–N y NO3–N entre sistemas de pH bajo casi se mantuvieron en un nivel más bajo. Mientras tanto, el cultivo de lodo en pH 5,5 demostró que la adición de AHL obviamente no revierte tanto la disminución del número total de bacterias como de AOB y NOB. La diferente eficiencia de conversión de NH4+–N y NO2–N entre el sistema de pH bajo y otros sistemas puede atribuirse al efecto de la FNA. Estudios previos indicaron que la biosíntesis de AOB se inhibía cuando el nivel de FNA alcanzaba 0,1 mg/L, y NOB era más sensible a FNA que se inhibía cuando el nivel de FNA alcanzaba 0,02 mg/L24. Combinado con los resultados experimentales de 3.1 y 3.2, se puede ver que la alta concentración de FNA en condiciones ácidas inhibió el crecimiento de bacterias. La concentración de FNA estuvo en el rango de 0,13 a 0,64 en el sistema ácido, superior al umbral de inhibición mencionado anteriormente, mientras que la FNA en otros grupos fue inferior a 0,02 mg/L. Cuando el ambiente circundante era adecuado para el crecimiento de bacterias, la actividad de las bacterias y la concentración de moléculas señal secretadas por las bacterias estaban ambas en el rango apropiado. Por lo tanto, la promoción de AHL exógena en la bacteria no fue significativa y no hubo diferencia significativa entre N-BR y N-ER (p < 0,05). Cuando el sistema estaba a baja temperatura o en presencia de inhibidores, se inhibió la actividad de las bacterias nitrificantes y, en consecuencia, se redujo la eficiencia de utilización de AHL. Después de agregar AHL, la actividad de las bacterias nitrificantes aumentó y el uso de las moléculas de señal circundantes fue más suficiente, por lo que aumentó la proporción de AOB y NOB en la población total de bacterias, lo que indica que AOB y NOB dominan gradualmente en la competencia con el simbiótico. bacterias Esto también fue demostrado por Li et al. que la eliminación de amoníaco tuvo un efecto similar a la dosificación con AHL10. El sistema QS de microorganismos suele jugar un papel importante en la utilización racional de recursos y espacio25,26. El sistema QS podía regular el crecimiento de las bacterias nitrificantes y luego ocupaba más espacio y recursos, haciendo que AOB y NOB se convirtieran en la cepa dominante en algunas condiciones ambientales adversas.

En la actualidad, no está claro cómo actúan los AHL sobre las bacterias nitrificantes en algunas condiciones ambientales adversas. Una hipótesis es que los AHL pueden regular las comunidades bacterianas y, por lo tanto, afectar las relaciones simbióticas y provocar cambios en las bacterias nitrificantes en el lodo nitrificante. En este estudio se encontró que las funciones y la estructura de la comunidad bacteriana nitrificante eran altamente sensibles a las AHL. Cuando el sistema estaba a baja temperatura o en presencia de DCD, la expresión génica producida por la adición exógena de AHL se había documentado a nivel individual o comunitario de bacterias. Sin embargo, vale la pena señalar que no todos los miembros de una comunidad se vieron afectados de manera similar por las AHL. En el estudio de adición de AHL, los 36 miembros de la comunidad más abundantes respondieron de manera diferente a los AHL. Este fenómeno también había sido observado en otras investigaciones21. Además, estudios previos han demostrado que los productores de AHL eran más sensibles a la adición de AHL. En este estudio, la abundancia de 7 bacterias aumentó después de la adición exógena de AHL, incluidas Nitrosomonas, Nitrospira, Ferruginibacter, Thauera, Hyphomicrobium, Mycoplasma y Bacillus, mientras que la mayoría de estas bacterias no reportaron la producción de moléculas de señalización. La influencia de la estructura, la función y la composición de la comunidad debe abordarse plenamente en estudios posteriores. Varios tipos de AHL producidos por AOB se habían demostrado en el sobrenadante en estudios previos23. La formación de biopelículas de Nitrosomonas europaea está estrechamente relacionada con QS, y la adición de AHL exógena puede ayudar a que recupere rápidamente su actividad en un estado de inanición. Sin embargo, no se detectaron homólogos de AHL sintasa en esta bacteria, lo que sugiere que Nitrosomonas europaea puede utilizar AHL y sintetizar AHL de otra manera12,27. Estas investigaciones indican que la presencia de AHL tiene el potencial de mejorar las actividades incitadoras de AHL de AOB en condiciones estresantes, lo que se confirmó nuevamente en nuestras pruebas por lotes sobre la eficiencia de utilización de AHL por bacterias. Aunque el mecanismo detrás de este fenómeno debe investigarse más a fondo, estos resultados ofrecen la posibilidad de que las bacterias nitrificantes puedan aumentar el uso de AHL para superar las condiciones de vida adversas. Pero el método de adición de AHL podría no funcionar para todas las condiciones. En un buen estado de crecimiento, las bacterias nitrificantes no dependían en gran medida del QS, ya que la eficiencia de eliminación de NH4+–N en el sistema de adición de AHL no aumentó significativamente. Las moléculas de señal no dependen de la concentración, y la adición adecuada de moléculas de señal puede ayudar a promover la estabilidad de la comunidad y la eliminación de contaminantes19. En combinación con los resultados anteriores, la estrategia de adición de AHL debe considerarse con otros factores ambientales, especialmente el valor de pH.

Este estudio reveló el papel potencial de las AHL en la supervivencia de la comunidad de bacterias nitrificantes en determinadas condiciones adversas (baja temperatura, bajo nivel de pH y presencia de DCD). El grupo DCD y el grupo de baja temperatura tratados con AHL tuvieron un mejor desempeño, y la abundancia de bacterias nitrificantes y la actividad QS fueron significativamente más altas que las del grupo control. El análisis de la comunidad y la qPCR indicaron que la QS puede desempeñar funciones funcionales en la reestructuración de la comunidad al fortalecer las especies de bacterias nitrificantes. Sin embargo, la adición de AHL en condiciones normales (28 °C, pH = 8) o en condiciones ácidas (pH 5,5) no tuvo cambios significativos en el sistema, lo que puede deberse a la fuerte actividad bacteriana en condiciones normales y al espacio limitado para mejoras adicionales. y la influencia de las condiciones ácidas sobre las bacterias nitrificantes fue mayor que la de las AHL. Por lo tanto, la estrategia de regulación de los AHL sobre la nitrificación bajo factores adversos debe considerarse en combinación con el valor de pH del sistema.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual no están disponibles públicamente debido a que también forman parte de un estudio en curso, pero están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Descargar referencias

El más profundo agradecimiento se dirige ante todo al profesor Mike Manefield por su apoyo y sugerencias sobre la prueba preliminar de este estudio. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención número 51808200) y el Fondo para la Construcción de Laboratorios Clave de la Provincia de Hubei (Fondo de Apertura de Laboratorios Clave de Hubei para el Desarrollo Regional y la Respuesta Ambiental, Subvención número 2019(A)001).

Wuhan Planificación y Diseño Co., LTD, Wuhan, 430010, China

Xiangguo Zeng

Facultad de Recursos y Ciencias Ambientales, Universidad de Hubei, Wuhan, 430062, China

huizhi hu

Laboratorio clave de desarrollo regional y respuesta ambiental de Hubei, Wuhan, 430062, China

huizhi hu

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XZ: Conceptualización, software, investigación, curación de datos, redacción: borrador original. HH: Investigación, curación de datos, redacción: revisión y edición, supervisión, adquisición de fondos.

Correspondencia a Huizhi Hu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Zeng, X., Hu, H. Funciones potenciales de las acil homoserina lactonas (AHL) en la supervivencia de las bacterias nitrificantes en determinadas circunstancias adversas. Informe científico 13, 705 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23123-x

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Recibido: 27 mayo 2022

Aceptado: 25 de octubre de 2022

Publicado: 06 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23123-x

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