Construcción de una subunidad | Orgullo Co., Ltd de Nanning del pavo real

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 19183 (2016) Citar este artículo

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Las metalochaperonas son proteínas de unión a metales diseñadas para entregar el metal apropiado a una proteína objetivo. El metal generalmente se transfiere entre diferentes proteínas. En este estudio, descubrimos que el metal se transfirió entre la misma subunidad de una nitrilo hidratasa mutante (NHase). Varias "proteínas activadoras" median el tráfico de iones metálicos en NHasas. Construimos NHasas de fusión fusionando las subunidades β y α y/o las "proteínas activadoras" de la NHasa de Pseudomonas putida. Las NHases de fusión exhibieron mayor termoestabilidad y tolerancia a altas concentraciones de la amida del producto. El mecanismo de la incorporación de cobalto cambió de un patrón de intercambio de subunidades propias a un patrón de chaperona molecular específico de apoproteína in vivo y un patrón de metalochaperona in vitro. En particular, la transferencia de cobalto se produjo entre la misma subunidad α en el patrón de metalochaperona. Estos resultados no solo demostraron la superioridad de las NHasas de tipo fusión, sino que también revelaron un innovador patrón de transferencia de iones metálicos en la biosíntesis de metaloproteínas.

Las metaloproteínas se han caracterizado intensamente durante décadas y más de un tercio de todas las proteínas son metaloproteínas1. Las funciones mediadas por los iones metálicos en las proteínas incluyen la transferencia de electrones, el transporte de oxígeno, la regulación de genes y la estabilización de estructuras2. Varios mecanismos generales de biosíntesis de metalocentros fueron informados en una revisión3; uno de ellos es el suministro de metalochaperones de un ion metálico o moléculas que contienen metales. Las metalochaperonas son proteínas de unión a metales diseñadas para entregar el ion metálico apropiado o las moléculas que contienen metales a una proteína objetivo. La proteína diana y la metalochaperona suelen ser proteínas diferentes y la proteína diana exhibe especificidad de ligando y más afinidad por el ion metálico.

La nitrilo hidratasa (NHase, EC 4.2.1.84)4 es una enzima que cataliza la hidratación de una amplia gama de nitrilos a las amidas correspondientes5. La enzima está compuesta por subunidades α y β y contiene hierro no hemo (Fe-NHase)6 o cobalto que no es corrina (Co-NHase)7,8. El tráfico de iones metálicos en NHasas está mediado por las correspondientes "proteínas activadoras"9. Se ha demostrado que los activadores de las Fe-NHasas actúan como metalochaperones10, mientras que las "proteínas activadoras" actúan como "chaperones de intercambio de subunidades propias" para la incorporación de cobalto en la mayoría de las Co-NHasas9,11,12.

El intercambio de subunidades propias es uno de los pasos de maduración postraduccional de la familia Co-NHase11. La proteína activadora existe como un complejo con la subunidad α de NHase y la incorporación de cobalto en NHase depende del intercambio de la subunidad α entre la subunidad α libre de cobalto de NHase y la subunidad α que contiene cobalto del complejo9. El intercambio de subunidades propias es bastante diferente de los mecanismos generales actualmente conocidos de biosíntesis de metalocentros9,11,13, que fueron informados en una revisión por Kuchar y Hausinger3, de la siguiente manera: (i) unión reversible de iones metálicos; (ii) suministro de metaloacompañante de un ión metálico o cofactor; (iii) modificación postraduccional creando un sitio de unión de metal; (iv) unión sinérgica de un metal con otro componente; (v) síntesis de cofactores que contienen metales; (vi) incorporación de metal junto con transferencia de electrones; y (vii) requisito de una chaperona molecular específica de apoproteína y así sucesivamente14. El intercambio de subunidades propias se descubrió por primera vez en la L-NHasa de Rhodococcus rhodochrous J19 y, posteriormente, en la H-NHasa de la misma cepa11 y se especula que ocurre en varias otras Co-NHasas y una enzima de la familia NHasa, la tiocianato hidrolasa, que también contiene un centro único de cobalto sin corrina con dos ligandos de cisteína modificados postraduccionalmente12,15. Las "chaperonas de intercambio de subunidades propias" exhiben una función proteica sorprendente en contraste con las metalochaperonas en la biosíntesis de metalocentros y las chaperonas moleculares en el plegamiento de proteínas9,11.

NHase se usa ampliamente en la producción industrial de acrilamida y nicotinamida4 altamente purificadas. Sin embargo, la mayoría de las NHas con alta actividad son inestables durante la aplicación industrial16. Por ejemplo, las NHasas de Pseudomonas chlororaphils B23 y Rhodococcus sp. N-774 son estables por debajo de 20 °C17,18 y la NHase de Rhodococcus rhodochrous J1 es meramente estable entre 10 y 30 °C19. Debido a que la hidratación de nitrilo es una reacción exotérmica, es necesario mantener una temperatura de reacción baja para estabilizar las NHas por refrigeración, lo que generalmente provoca un enorme costo de energía redundante16. Además, la tolerancia a altas concentraciones del producto amida es necesaria en la fabricación industrial. Por lo tanto, se requiere una NHasa más estable con alta actividad y alta tolerancia para la fabricación industrial.

La fusión de genes de subunidades puede mejorar la estabilidad de la proteína20,21,22. La fusión de genes es una estrategia para hacer que dos o más genes previamente distintos se fusionen en un solo marco de lectura abierto. Además, se ha informado que los eventos de fusión tienden a optimizar el ensamblaje al simplificar las topologías de complejos de proteínas23. Recientemente, se ha predicho una nueva estructura génica de NHase en el eucariota Monosiga brevicollis24. Las dos subunidades de NHasa normalmente separadas (subunidades β y α) se fusionan en un péptido en esta NHasa. Se prevé que la NHasa de fusión tenga características beneficiosas, como mayor actividad, mayor estabilidad o nuevas especificidades de sustrato24. Por lo tanto, la estrategia de fusión de genes podría ser una herramienta eficaz para mejorar la aplicación de la NHase.

En este estudio, construimos un nuevo tipo de NHase con un solo polipéptido fusionando las subunidades β y α de la NHase de Pseudomonas putida NRRL-18668 (P. putida). La NHase de fusión exhibió una termoestabilidad y una tolerancia al producto significativamente más altas que el tipo salvaje. La proteína activadora P14K también fue necesaria para la activación de NHase de fusión. Además, P14K se fusionó adicionalmente con la NHasa de fusión de las subunidades β y α, lo que dio como resultado la formación de otra NHasa de fusión. El mecanismo de incorporación de cobalto de la NHase cambió debido a estas alteraciones estructurales. El complejo α(P14K)2 (dos P14K se combinaron con la subunidad α) desempeñó un papel como metalochaperona para transferir un ion cobalto a las NHases de fusión in vitro. La transferencia de cobalto se produjo en la misma subunidad α entre la NHasa sin cobalto (apo-NHasa) y el complejo α(P14K)2, lo que reveló un innovador patrón de transferencia de iones metálicos en la biosíntesis de metaloproteínas. Además, lo más probable es que P14K actúe como chaperona molecular específica de apoproteína para la incorporación de cobalto in vivo.

La NHase de P. putida se construyó previamente y se sobreexpresó con éxito en Escherichia coli BL2125. Sobre la base de la estructura del gen de Monosiga brevicollis, construimos dos NHases mutantes con fusión de genes de subunidades. Los genes de las subunidades β y α previamente diferenciados (genes B y A) se fusionaron con un enlazador (dipéptido, prolina-glicina) en un solo gen (BA); el gen fusionado (BA) se insertó en el plásmido pET28a, dando como resultado pET28a-(BA) (Fig. 1a). A continuación, el gen activador P14K se insertó aguas abajo del gen mutante (BA), lo que dio como resultado pET28a-(BA)P14K. Los transformantes que albergaban pET28a-(BA) y pET28a-(BA)P14K se usaron para expresar NHase. Como resultado, se detectó actividad NHase y cada una de las bandas de proteína correspondientes de los transformantes fue evidente en SDS-PAGE, lo que indica que las dos NHase de fusión se expresaron con éxito (Fig. 1b). De aquí en adelante, las NHasas de fusión codificadas por el gen (BA) y (BA)P14K se denominan respectivamente NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K.

Construcción, expresión y purificación de las NHasas recombinantes.

(a) Organización genética para la construcción de un conjunto de plásmidos. (b) SDS-PAGE de un extracto libre de células de cada transformante. 1, marcador; 2, NHasa de tipo salvaje; 3, NHasa-(BA); 4, NHasa-(BA)P14K; 5, NHasa-(BAP14K). (c) SDS-PAGE de las enzimas purificadas. 1, marcador; 2, NHasa de tipo salvaje; 3, NHasa-(BA); 4, NHasa-(BA)P14K; 5, NHasa-(BAP14K).

NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K se purificaron y caracterizaron (Fig. 1c) y se compararon con la NHase de tipo salvaje. Como se muestra en la Tabla 1, la actividad específica y la kcat de NHase-(BA)P14K fueron más altas que las de la NHase de tipo salvaje, lo que demuestra que la fusión de las subunidades β y α aumentó la actividad. El contenido de cobalto de NHase-(BA) fue aproximadamente el 14% de NHase-(BA)P14K, lo que indica que P14K también era necesario para la incorporación de cobalto, incluso en la fusión NHase (Tabla 1). La constante de Michaelis (valor Km) de NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K fue mayor (aproximadamente 1,5 veces) que la de la NHase de tipo salvaje, lo que indica que la fusión de las subunidades β y α podría restringir el proceso de unión del sustrato al centro activo. El análisis de masa MALDI-TOF de la NHase-(BA)P14K indicó que la NHase-(BA)P14K tiene la longitud total de βα (Fig. S1). La NHasa de tipo salvaje es un tetrámero (α2β2); la masa molecular de las enzimas de fusión se determinó mediante cromatografía de filtración en gel. Las masas moleculares de NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K fueron 97,8 kDa y 85,1 kDa, respectivamente (Fig. 2). Debido a que la masa molecular calculada de βα fusionada es de 49,2 kDa, ambas NHasas de fusión deben ser dímeros [(βα)2]. Utilizando el análisis de espectros de dicroísmo circular (CD) de ultravioleta lejano, realizamos una comparación detallada de cada propiedad entre la NHase, NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K de tipo salvaje. Los espectros de NHase-(BA) y NHase-(BA)P14K fueron diferentes de los de la NHase de tipo salvaje (Fig. 3a), lo que indica que la estructura secundaria de NHase-(BA) o NHase-(BA)P14K no es el mismo que el de la NHase de tipo salvaje.

Determinación de la masa molecular y estructuras de las NHasas de fusión.

Proteínas marcadoras utilizadas para la filtración en gel: (i) glutamato deshidrogenasa (levadura) (290 kDa); (ii) lactato deshidrogenasa (corazón de cerdo) (142 kDa); (iii) enolasa (levadura) (67 kDa); (iv) mioquinasa (levadura) (32 kDa); y (v) citocromo c (corazón de caballo) (12,4 kDa).

Far-UV CD (a) y espectros de absorción UV-Vis (b-d) de la NHase de tipo salvaje y las NHases de fusión.

P14K era necesario para la incorporación de cobalto en la NHasa de tipo salvaje y las NHasas de fusión. Intentamos construir un gen de proteína de fusión de tres subunidades (BAP14K), que además fusionaba P14K con el extremo (βα)-carboxilo de NHase-(BA). El gen fusionado (BAP14K) se insertó en el plásmido pET28a, dando como resultado pET28a-(BAP14K) (Fig. 1a). El transformante que alberga pET28a-(BAP14K) se usó para la expresión de NHase. Como resultado, la banda de proteína correspondiente de la NHase mutante se detectó en SDS-PAGE (Fig. 1b), lo que indica que la NHase de fusión se expresó con éxito. De aquí en adelante, la fusión NHase codificada por el gen (BAP14K) se denomina NHase-(BAP14K). La NHase-(BAP14K) se purificó y caracterizó (Fig. 1c). Como se muestra en la Tabla 1, la actividad específica y kcat de NHase-(BAP14K) fueron más altas que las de NHase de tipo salvaje y las diferencias de actividad específica y kcat entre NHase-(BAP14K) y NHase-(BA)P14K fueron pequeñas. . En comparación con NHase y NHase-(BA)P14K de tipo salvaje, el valor Km de NHase-(BAP14K) fue el más alto, lo que indica que la fusión de P14K restringió aún más la unión al sustrato. La masa molecular de la NHase-(BAP14K) se determinó mediante cromatografía de filtración en gel. La masa molecular de la NHase-(BAP14K) fue de 150,6 kDa. Debido a que la masa molecular calculada de la fusión βαP14K es de 67,0 kDa, la NHasa-(BAP14K) debería ser un dímero [(βαP14K)2] (Fig. 2). El espectro de CD de la NHase-(BAP14K) fue similar al de la NHase-(BA)P14K (Fig. 3a), lo que indica que la estructura secundaria de la NHase-(BAP14K) es similar a la de la NHase-(BA) )P14K pero es diferente del tipo salvaje.

Debido a que NHase-(BAP14K) exhibió una mayor actividad de NHase que el tipo salvaje, estudiamos el efecto de la ubicación de P14K en la actividad de NHase de fusión. Diseñamos dos genes NHase más de fusión de tres subunidades, (BP14KA) y (P14KBA). En (BP14KA), el gen P14K estaba ubicado entre los genes de las subunidades β y α; en (P14KBA), el gen P14K estaba por delante del gen de la subunidad (βα) (Fig. 1a). Los transformantes que albergaban pET28a-(BP14KA) y pET28a-(P14KBA) se usaron para expresar respectivamente NHase-(BP14KA) y NHase-(P14KBA). Las NHasas de fusión se purificaron y ensayaron. La actividad de NHase-(BP14KA) fue de 148,6 U/mg, aproximadamente el 32% de la de NHase-(BAP14K) (452,5 U/mg); la actividad de NHase-(P14KBA) fue de 76,7 U/mg, aproximadamente el 17% de la de NHase-(BAP14K). Estos hallazgos demostraron que la ubicación de P14K afectó significativamente la actividad de NHases de fusión. Cuando el P14K se localizaba aguas abajo del término (βα)-carboxilo, la NHasa de fusión mostraba la mayor actividad.

La actividad específica y kcat de NHase-(BA)P14K y NHase-(BAP14K) fueron más altas que las de la NHase de tipo salvaje; por lo tanto, los comparamos más en términos de su termoestabilidad y tolerancia al producto. Las enzimas se incubaron a 50°C en tampón de fosfato de potasio (KPB) 10 mM (pH 7,5, que contenía ditiotreitol 0,5 mM) y se midió la actividad de cada NHasa cada diez minutos. Como se muestra en la Fig. 4a, los tiempos de vida media de NHase-(BA)P14K y NHase-(BAP14K) fueron respectivamente 2,8 y 2 veces más largos que los del tipo salvaje, lo que sugiere que NHase-(BA)P14K y NHase -(BAP14K) muestran una mayor termoestabilidad que la de la NHase de tipo salvaje.

Comparación de propiedades de las NHase de fusión con la NHase de tipo salvaje.

( a ) El análisis de la termoestabilidad, ( b ) la tolerancia del producto y ( c ) el pH óptimo de las NHase de fusión y la NHase de tipo salvaje.

Además de la termoestabilidad, la alta acumulación del producto es beneficiosa para la producción industrial a gran escala, lo que conduce al ahorro de energía y la simplificación del proceso posterior19. Para comparar la tolerancia de una amida de alta concentración del tipo salvaje y las enzimas de fusión, usamos nicotinamida para probar la tolerancia del producto de las NHasas. La reacción se llevó a cabo en 3-cianopiridina 20 mM (sustrato) con y sin nicotinamida 0,5 M (producto) durante 10 minutos. Se midió la reducción de 3-cianopiridina en cada reacción (Fig. 4b) y se calculó la proporción de reducción (la proporción de la cantidad reducida de 3-cianopiridina en la reacción con y sin nicotinamida 0,5 M). Las proporciones de reducción de NHase-(BA)P14K y NHase-(BAP14K) fueron 0,86 y 0,83, respectivamente, que fueron más altas que las del tipo salvaje (0,80), lo que indica que las NHasas de fusión exhibieron una mayor tolerancia al producto que las del tipo salvaje. tipo.

Los valores de pH fisiológicamente óptimos de la mayoría de las NHasas varían entre 6,5 y 8,5 y la NHasa de P. putida tiene un amplio máximo de actividad entre pH 7,2 y 7,826. Se midió el pH óptimo de las NHasas de fusión y se comparó con el tipo salvaje. Como se muestra en la Fig. 4c, el pH óptimo del tipo salvaje, NHase-(BA)P14K y NHase-(BAP14K) fue de 7,5, 8,0 y 7,5, respectivamente. Aunque NHase-(BAP14K) mostró un rango estable similar al del tipo salvaje, el rango estable de NHase-(BA)P14K fue más amplio, de 6,5 a 9,0, lo que sugiere que esta fusión podría ampliar el rango de pH adecuado de NHase .

P14K es necesario para la incorporación de cobalto en la NHase de P. putida12. P14K forma un complejo α(P14K)2 con la subunidad α de la NHase. Se confirma que la incorporación de cobalto en la NHase depende de la sustitución de la subunidad α entre la α(P14K)2 que contiene cobalto y la apo-NHase, lo que da como resultado la formación de NHase12 funcional. P14K también fue necesario para la incorporación de cobalto en las NHases de fusión (Tabla 1). Aquí, estudiamos si α(P14K)2 podría activar las NHases de fusión. El α(P14K)2 que contiene cobalto purificado se obtuvo agregando una etiqueta Strep delante de P14K como se describió anteriormente12 (Fig. 1a). Las NHasas de fusión sin cobalto [apo-NHase-(BA), apo-NHase-(BA)P14K y apo-NHase-(BAP14K)] se purificaron del cultivo en ausencia de cobalto. La NHasa de tipo salvaje apo también se purificó y se usó como control. La apo-NHase de tipo salvaje, la apo-NHase-(BA), la apo-NHase-(BA)P14K y la apo-NHase-(BAP14K) purificadas se mezclaron respectivamente con el α(P14K)2 que contiene cobalto purificado y luego se incubaron. . La actividad NHase en todas las mezclas aumentó a medida que aumentaba el tiempo de incubación y se observó la mayor actividad de las NHase de fusión en 1 hora. A continuación, cada NHasa resultante [NHasa de tipo salvaje R, R-NHasa-(BA), R-NHasa-(BA)P14K y R-NHasa-(BAP14K)] se purificó de las mezclas y se analizó. La actividad de NHase de la NHase de tipo salvaje R fue similar a la de la NHase de tipo salvaje, lo que concuerda con los principios del intercambio de subunidades propias informado anteriormente12. Curiosamente, las actividades NHase de R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) fueron 240,5 y 219,2 U/mg, respectivamente, que fueron aproximadamente el 50 % de las NHasas de fusión que contienen cobalto correspondientes. La R-NHasa-(BA) también mostró una actividad del 30% (147,2 U/mg) de las NHasas de fusión que contienen cobalto (Tabla 1).

El ion cobalto es necesario para la actividad NHase. Las apo-NHasas de fusión fueron activadas por α(P14K)2. Estos resultados indican que el ion cobalto se transfirió de α(P14K)2 a las apo-NHasas de fusión. Para confirmar la transferencia de cobalto entre α(P14K)2 y las apo-NHasas de fusión, se realizaron análisis de espectros de absorción UV-Vis. Como se muestra en la Fig. 3, todas las enzimas resultantes exhibieron un hombro adicional en la región de 300 a 350 nm (Fig. 3b) similar a las de las NHasas (NHasas que contienen cobalto) (Fig. 3c), mientras que las no se detectó hombro adicional en las apo-NHases (Fig. 3d). Estos hallazgos sugirieron que R-NHase-(BA), R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) eran enzimas que contenían cobalto. Se determinó el contenido de cobalto, como se muestra en la Tabla 1. R-NHase-(BA), R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) contenían respectivamente 0,23 mol ion/mol (βα), 0,61 mol ion /mol (βα) y 0,62 mol ion/mol (βαP14K). Por el contrario, también mezclamos apo-NHase, apo-NHase-(BA), apo-NHase-(BA)P14K y apo-NHase-(BAP14K) con ion cobalto e incubamos. No se detectó actividad significativa en estas mezclas (datos no mostrados), lo que indica que las NHasas de fusión no pudieron activarse al mezclarlas con ión cobalto in vitro, incluso para apo-NHasa-(BAP14K), que contenía el fragmento de P14K.

La unión de iones metálicos es responsable de la modificación postraduccional de las dos cisteínas en la subunidad α en NHase3,26. Sin embargo, tales modificaciones no pudieron observarse en apo-NHase26. Estos resultados nos permitieron especular que los residuos de cisteína están modificados en NHase de fusión que contiene cobalto, pero no en apo-NHase. Para aclarar el estado de oxidación de cisteína del sitio activo antes y después de la inserción de cobalto, analizamos apo-NHase-(BA)P14K, apo-NHase-(BAP14K), R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) por NanoLC-ESI-MS/MS. Las enzimas se trataron con tripsina después de la reducción y carboxamidometilación. Se midió la masa molecular del péptido hidrolizado con tripsina que contenía todos los residuos de ligando metálico V351CTLCSCYPWPTLGLPPAWYK371 (VK21). En el espectro de masas del digerido tríptico de apo-NHase-(BA)P14K y apo-NHase-(BAP14K) (Fig. 5a,c, interior), encontramos que el pico de masa con m/z 1286.15 y 1285.95 respectivamente correspondía al valor m/z del ion [M+2H]2+ de VK21 con tres carboxamidometil (CAM-)cisteína (el valor m/z calculado fue 1285,94). Sin embargo, en el espectro de masas del digerido tríptico de R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) (Fig. 5b, d, adentro), encontramos que el pico de mayor masa con m/z 1272.83 y 1272,82 correspondieron respectivamente al valor m/z del ion [M+2H]2+ de VK21 ambos con Cys-SO2H y dos CAM-cisteína (el valor m/z calculado fue 1273,44). Para identificar los residuos modificados, realizamos la secuenciación MS/MS de los iones con m/z 1286,15, 1272,83, 1285,95 y 1272,82. Los espectros concordaban bien con el patrón de fragmentación predicho de VK21 con Cys355-SO2H en R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K) y CAM-Cys355 en apo-NHase-(BA)P14K y apo- NHase-(BAP14K). Aunque no se ha confirmado la aparición de la modificación Cys-SOH debido a su inestabilidad química27, estos resultados sugieren fuertemente que los residuos de cisteína oxidados existen en las dos NHasas de fusión después de la inserción de cobalto.

Identificación de Cys355-SO2H por análisis MS/MS.

Cada ion doblemente cargado correspondiente al péptido VK21 de (a) apo-NHase-(BA)P14K, (b) R-NHase-(BA)P14K, (c) apo-NHase-(BAP14K), (d) R- NHase-(BAP14K) se analizó mediante un sistema NanoLC-ESI-MS/MS. Los picos de masa con m/z 1286,15 y 1285,95 correspondientes al ion [M+2H]2+ del péptido VK21 con tres CAM-cisteína (el valor m/z calculado fue 1285,94) se mostraron dentro de (a,c); los picos de masa con m/z 1272.83, 1272.82 corresponde al ion [M+2H]2+ del péptido VK21 con un Cys-SO2H y dos CAM-cisteína (el valor m/z calculado fue 1273.44) se mostraron dentro de b, d. Los iones del fragmento N- y C-terminal en un enlace peptídico están marcados respectivamente en la figura como by y. Los iones b5 y b4 indicaron claramente que Cys355 se oxidó al ácido sulfínico en R-NHase-(BA)P14K y R-NHase-(BAP14K), pero no en apo-NHase-(BA)P14K y apo-NHase-( BAP14K). b* significa ion de tipo b después de la desaminación e y* significa ion de tipo y después de la desaminación.

Se ha confirmado que la incorporación de cobalto en la NHasa de P. putida depende del intercambio de la subunidad α entre la subunidad α libre de cobalto de la apo-NHasa y la subunidad α que contiene cobalto de la α(P14K)212 (Figura 6a). Para las NHasas de fusión, P14K también era necesaria para la activación de las NHasas de fusión y se encontró que el ion cobalto se transfirió de α(P14K)2 a las NHasas de fusión in vitro (Tabla 1). Es poco probable que se produzca un intercambio de subunidades α entre las NHasas de fusión y α(P14K)2 porque la subunidad α está fusionada con la subunidad β como un polipéptido en la NHasa de fusión. Por lo tanto, es probable que el ion cobalto en la subunidad α de α(P14K)2 se haya transferido directamente al dominio de la subunidad α de las NHasas de fusión. En este proceso, α(P14K)2 probablemente actuó como metalochaperona para la transferencia de iones de cobalto. El ion cobalto se transfirió entre las mismas dos subunidades α.

Mecanismo propuesto de incorporación de cobalto en la fusión NHase.

( a ) Intercambio de subunidades propias para la incorporación de cobalto en la NHase de tipo salvaje. (b) Transferencia de cobalto de α(P14K)2 a apo-NHase-(BA)P14K in vitro. La subunidad apo α en apo-NHase-(BA)P14K se acerca y se une al sitio de reconocimiento (unión) de P14K durante el intercambio de subunidades propias11 y luego la subunidad β (de apo-NHase-(BA)P14K) y el La subunidad α que contiene cobalto (de α(P14K)2) se atrae a través de la interacción electrostática y se asocia entre sí para formar un complejo intermedio. En lugar de intercambio de subunidades α entre las dos proteínas, se produce una transferencia directa de iones de cobalto. La oxidación de las dos cisteínas es responsable de la unión del cobalto, lo que da como resultado una NHasa-(BA)P14K activa. (c) Incorporación de cobalto en la fusión apo-NHase-(BA)P14K in vivo. P14K contacta directamente con el dominio de la subunidad α de la proteína βα de fusión porque los sitios de unión en la subunidad α están libres debido a la fusión, lo que da como resultado un complejo intermedio para la inserción de cobalto y la oxidación de dos cisteínas. En estos modelos, se usa una proteína βα de fusión para mostrar apo-NHase-(BA)P14K, el cambio de ubicación de las dos argininas se usa para demostrar un mayor plegamiento después de la incorporación de cobalto.

Los iones metálicos tanto en Fe-NHase como en Co-NHase están ubicados en sus subunidades α, que comparten un motivo de unión a metal característico (CXLC(SO2H)SC(SOH)) que contiene dos residuos de cisteína oxidados: ácido cisteína-sulfínico (Cys-SO2H ) y ácido cisteína-sulfénico (Cys-SOH)4,28,29,30. Los residuos de cisteína oxidados son esenciales para la actividad de NHase9,31, lo que indica que los dos residuos de cisteína en las NHase de fusión deben oxidarse. Se encuentra que los dos residuos de cisteína oxidados correspondientes existen en la subunidad α de αe2 (el complejo utilizado para el intercambio de L-NHasas en la subunidad propia en R. rhodochrous J1)9, lo que sugiere que los dos residuos de cisteína en α(P14K) 2 debe ser oxidado. Las metalochaperonas son proteínas de unión a metales diseñadas para entregar el ion metálico o el cofactor metálico adecuado a sus objetivos altamente específicos3. El ión metálico o el cofactor metálico generalmente se transfiere entre dos proteínas diferentes y la transferencia depende de la especificidad y afinidad del ligando por el ión metálico o el cofactor metálico, como la metalochaperona de cobre que transfiere iones de cobre a la ATPasa y la superóxido dismutasa32,33,34,35 y metalochaperonas de níquel que transfieren iones de níquel a ureasa e hidrogenasa36,37,38. Durante estos procesos, las metalochaperonas de cobre son completamente diferentes a la ATPasa y la superóxido dismutasa y las metalochaperonas de níquel son completamente diferentes a la ureasa y la hidrogenasa, las proteínas diana deberían exhibir una mayor especificidad y afinidad de ligando que las metalochaperonas. Sin embargo, aunque α(P14K)2 y NHase son dos proteínas diferentes, las subunidades α en α(P14K)2 y en la fusión NHase tienen la misma secuencia de aminoácidos y deberían tener los mismos ligandos de ion cobalto. Por lo tanto, descubrimos un patrón de transferencia de iones metálicos para la biosíntesis de metaloproteínas, en el que un ión metálico se transporta entre las mismas subunidades de proteínas en diferentes complejos de proteínas.

Es misterioso que el ion cobalto se transfiera dentro de la misma proteína con el mismo entorno de ligando. Este fenómeno puede estar relacionado con la estructura del sitio activo de NHase. Los Cys-SO2H y Cys-SOH oxidados postraduccionalmente tienen estructuras Cys-SO2− y Cys-SO− desprotonadas, respectivamente, y Cys-SO2− y Cys-SO− desprotonadas en la subunidad α forman puentes salinos con dos arginina de la subunidad β de la NHase (Fig. S2)9. Solo se necesita la fuerza electrostática para que la sal desencadene el intercambio de subunidades propias9. Los puentes de sal correspondientes no deberían existir en α (P14K) 2 porque P14K es más corto que la subunidad β y carece de la arginina correspondiente (Fig. S3). Los puentes de sal probablemente influyeron en el entorno del ligando del ion cobalto, lo que resultó en una mayor afinidad por el ion cobalto. Por lo tanto, cuando α(P14K)2 se mezcla con las NHasas de fusión, el ion cobalto se transfiere desde la subunidad α de α(P14K)2 al dominio de la subunidad α de las NHasas de fusión. El proceso de transferencia de cobalto está asociado con la oxidación de cisteína debido a la función de oxidación de cisteína de la chaperona autointercambiadora de subunidades9. Tal proceso se muestra en la Fig. 6b.

Mientras que la apo-NHasa-(BA)P14K fue activada por α(P14K)2 hasta el 50% de las NHasas de fusión, la apo-NHasa-(BA) fue activada solo hasta el 30% de actividad (Tabla 1). Estos hallazgos indican que la estructura de apo-NHase-(BA)P14K podría ser diferente de la de apo-NHase-(BA) y que la apo-NHase-(BA)P14K es más adecuada para la incorporación de cobalto por α(P14K)2 . La diferencia entre apo-NHase-(BA) y apo-NHase-(BA)P14K está en la presencia o ausencia del gen P14K, lo que indica que la proteína P14K afecta la estructura de fusión NHase y podemos especular que P14K probablemente también actúa como un chaperona molecular para el plegamiento de NHase.

Aunque el ion cobalto se transfirió de α(P14K)2 a las NHasas de fusión in vitro (Tabla 1), este proceso no debería existir in vivo porque α(P14K)2 no se puede formar en una célula porque los β- y α- Las subunidades se fusionan en una sola proteína. Debido a que P14K es necesario para activar la expresión de NHase de fusión y actúa como acompañante molecular para el plegamiento de NHase, propusimos un proceso postraduccional para NHase-(BA)P14K in vivo. Como se muestra en la Fig. 6c, después de la traducción de los genes BA y P14K, P14K entra en contacto con el dominio de la subunidad α de la proteína βα de fusión y se inserta un ion cobalto en el dominio de la subunidad α con la ayuda de P14K. El plegamiento de proteínas ocurre con la ayuda de P14K después de la incorporación de cobalto, lo que da como resultado la formación de NHase de fusión funcional. P14K se disocia de la fusión NHase durante el proceso postraduccional25. En este proceso, P14K probablemente actúa como una chaperona molecular específica de apoproteína3 para la incorporación de cobalto en las NHasas de fusión, como GroEL, Hsp70 y Hsp40, que se unen y previenen el mal plegamiento o estimulan el replegamiento de una amplia gama de proteínas39.

Debido a que P14K primero se pone en contacto con el dominio de la subunidad α de la proteína βα fusionada para la incorporación de cobalto en las NHasas de fusión, surge la pregunta de por qué este proceso no podría ocurrir en la NHasa de tipo salvaje. P14K y otras chaperonas de intercambio de subunidades propias exhiben una similitud de secuencia significativa con la subunidad β de NHase correspondiente (aproximadamente 30% de homología) (Fig. S3) y ambas se conectan con la subunidad α. La subunidad β y P14K podrían tener los mismos sitios de unión en la subunidad α. Se produce una competencia por la unión de la subunidad α durante el proceso postraduccional de la NHasa de tipo salvaje. Como resultado, se forman tanto apo-NHase como α(P14K)2, seguido de un intercambio de subunidades propias para la biosíntesis de NHase. En este caso, P14K no podría unirse a la βα, porque los sitios de unión de la subunidad α están ocupados por la subunidad β. Para la NHase-(BA)P14K, la subunidad β se fusiona con la subunidad α y los sitios de unión de la subunidad α quedan libres. Por lo tanto, P14K se une directamente a los sitios de unión de la subunidad α de la fusión βα para la incorporación de cobalto.

Hemos descubierto que la incorporación de cobalto en la mayoría de las Co-NHasas depende del intercambio de subunidades propias tanto in vitro como in vivo9,11, mientras que el ion cobalto en la subunidad α de α(P14K)2 se transfiere directamente a la Dominio de la subunidad α de las NHasas de fusión en lugar del intercambio de subunidades propias in vitro (Tabla 1). Por lo tanto, surge otra pregunta de por qué la transferencia directa no podría ocurrir durante la biosíntesis de la NHasa de tipo salvaje. Es posible que ambos mecanismos ocurran en el proceso de biosíntesis de NHase de tipo salvaje; el mecanismo anterior sería el intercambio de subunidades propias. La unión del cobalto con la subunidad α es más estrecha que la unión de la chaperona de intercambio de subunidades propias con la subunidad α, por lo que el intercambio de subunidades α es más fácil que la transferencia directa de cobalto. Por lo tanto, aunque ambos mecanismos ocurren en el proceso de biosíntesis de NHase de tipo salvaje, el intercambio de subunidades propias podría ser anterior a la transferencia directa de cobalto. El mecanismo de espera de la transferencia directa de cobalto puede tener una función parcial para la incorporación de cobalto. Como resultado, apo-NHase-(BA)P14K y apo-NHase-(BAP14K) solo se activan parcialmente por α(P14K)2 (Tabla 1). Además, la chaperona de intercambio de subunidades propias juega un papel importante en la incorporación de iones de cobalto en la subunidad α. Se ha informado que la flexibilidad del dominio C terminal de P14K es uno de los factores clave para la incorporación de cobalto en la subunidad α40; las NHasas de fusión codificadas por los genes BP14KA y P14KBA afectarían la flexibilidad del dominio C terminal de P14K porque hay una subunidad α o β ubicada en el dominio C terminal de P14K, lo que reduce la flexibilidad. Esta puede ser una de las razones por las que las dos NHasas de fusión exhibieron menor actividad.

La fusión de genes obliga sustancialmente a un par de proteínas a interactuar permanentemente entre sí y el evento de fusión tiende a optimizar el ensamblaje al simplificar las topologías de complejos de proteínas23. Aquí, a través de una estrategia de fusión de genes, construimos dos NHases de fusión con propiedades superiores. El mecanismo de incorporación de cobalto se alteró junto con esta evolución molecular in vivo y descubrimos un patrón de transferencia de iones metálicos que ocurre entre las mismas proteínas in vitro, lo que reveló un comportamiento inesperado de una metalochaperona. El mecanismo de incorporación de cobalto en NHase es fantástico y variable y los detalles deben investigarse más a fondo.

El gen ABP14K que codifica la NHasa de tipo salvaje de P. putida se obtuvo de P. putida12. Los plásmidos pET-24a (+) y pET-28a (+) se usaron como vectores y se usó E. coli BL21 (DE3) para la sobreexpresión.

Los cebadores de oligonucleótidos utilizados en este estudio se muestran en la Tabla S1. El plásmido pET24a-BAP14K se usó como molde y se diseñaron cebadores B-Nde I-up y P-Hind III-down para la introducción de sitios de restricción Nde I y Hind III, respectivamente. El fragmento de ADN amplificado se purificó usando un kit de purificación PCR (Promega) y se digirió con Nde I y Hind III, se ligó en los sitios Nde I y Hind III de pET-28a (+), luego se transformó en E.coli JM109 y se secuenció. Si la secuencia era correcta, el extracto de plásmido de E.coli JM109 se transformaba en E.coli BL21 (DE3). Los plásmidos recombinantes (pET28a-(BA)P14K y pET28a-(BAP14K)) se construyeron mediante un protocolo de PCR de extensión superpuesto basado en pET28a-BAP14K. Para construir pET28a-(BA)P14K y pET28a-(BAP14K), se usaron pares de cebadores Linker1-up y Linker1-down para conectar las subunidades β y α y Linker2-up y Linker2-down para conectar α- y subunidades P14K. A continuación, pET28a-(BA) se construyó con los pares de cebadores B-Nde I-up y A-Hind III-down amplificando (BA) de pET28a-(BA)P14K y el producto PCR y pET-28a (+) fueron ambos digerido con Nde I y Hind III después de 4 horas. A continuación, el fragmento de ADN purificado se ligó en los sitios Nde I y Hind III de pET-28a (+). Los plásmidos recombinantes (pET28a-(BP14KA) y pET28a-(P14KBA)) se construyeron respectivamente mediante un protocolo de PCR de extensión superpuesto basado en pET28a-(BA) con el producto de PCR P14K-1 y P14K-2 como cebadores. El producto de PCR P14K-1 se amplificó con los pares de cebadores B(P)A-up y B(P)A-down y P14K-2 se amplificó con los pares de cebadores (P)BA-up y (P)BA-down con el pET24a-BAP14K como plantilla.

La E.coli recombinante para la expresión de la enzima se cultivó primero en 10 ml de medio líquido 2YT que contenía 50 μg/ml de kanamicina a 37 °C, luego se cultivó en 500 ml de medio líquido 2YT en un matraz de 2 litros que contenía 50 μg/ml. kanamicina a 37°C con agitación a 200 rpm. Cuando la densidad óptica a 600 nm (DO600) del cultivo alcanzó 0,8, se añadió isopropil β-D-1-tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 0,4 mM para inducir la expresión de NHasa y se añadió CoCl2.6H2O a una concentración final de 0,05 g/l para obtener NHasa madura. Posteriormente, el cultivo se incubó a 24 °C durante 16 h.

Todos los pasos de purificación se realizaron a 0-4 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación a 6000 × g durante 15 min, se resuspendieron en KPB 10 mM (que contenía ditiotreitol 0,5 mM, pH 7,4) y se lisaron mediante sonicación en hielo. Los sobrenadantes se eliminaron por centrifugación a 15.000 xg durante 15 min y se filtraron a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm. Para la purificación de proteínas sin ninguna etiqueta, se utilizó una columna DEAE-Sephacel (3 × 5 ml) (GE Healthcare UK Ltd.). En primer lugar, la columna se equilibró con KPB 10 mM y la proteína se eluyó con un gradiente lineal de KCl 0 a 0,5 M en KPB. Las fracciones activas se recogieron, se concentraron a 1 ml por ultrafiltración y se aplicaron a una columna SuperdexTM 200 10/300 GL (GE Healthcare UK Ltd.) y se equilibraron con KPB 10 mM, con un caudal de 0,5 ml/min. Para la purificación de enzimas marcadas con His, el filtrado se aplicó a una columna de cromatografía HisTrap HP (GE Healthcare) usando un purificador AKTA (GE Healthcare, Houston, TX). La columna se equilibró con tampón A (tampón de fosfato 50 mM, NaCl 0,3 M e imidazol 20 mM, pH 7,4) y las proteínas unidas se eluyeron con tampón B (tampón de fosfato 50 mM, NaCl 0,3 M e imidazol 500 mM, pH 7,4) . Asimismo, para la purificación de enzimas marcadas con Strep, se equilibró una columna StrepTrap HP (GE Healthcare UK Ltd.) con tampón de unión (Na2HPO4·12H2O 20 mM, NaCl 280 mM, KCl 6 mM, pH 7,4). Después de inyectar el sobrenadante en la columna e incubar durante media hora, eluimos las proteínas con tampón de elución (tampón de unión que contiene destiobiotina 25 mM, pH 7,4). Las fracciones activas se recogieron y el siguiente paso de filtración en gel fue el mismo que se mencionó anteriormente. Las proteínas purificadas se analizaron por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y la concentración de proteína se cuantificó por el método de Bradford41.

Para determinar las masas moleculares y las estructuras de las NHasas, las enzimas purificadas y las proteínas marcadoras se aplicaron a una columna SuperdexTM 200 10/300 GL (GE Healthcare UK Ltd.). Las masas moleculares se calcularon a partir de la curva estándar de proteínas marcadoras por extrapolación. Las estructuras de las enzimas se especularon a partir de las masas moleculares.

La actividad de NHasa se midió por el aumento de producto. La mezcla de reacción (0,5 ml) contenía KPB 10 mM (pH 7,4), 3-cianopiridina 200 mM y 10 µl de la cantidad apropiada de solución enzimática. La reacción se realizó a 25°C durante 10 min y se detuvo con la adición de 0,5 ml de acetonitrilo. La cantidad de producto formado se determinó midiendo la absorbancia a 215 nm y extrapolando de una curva estándar. Una unidad (U) de actividad NHase se define como la cantidad de enzima que libera 1 μmol de nicotinamida por minuto en estas condiciones de ensayo.

Las enzimas purificadas (0,5 mg/ml) se analizaron con un espectrofotómetro de absorción atómica Shimadzu AA-7000 en las siguientes condiciones: longitud de onda, 240,73 nm; corriente de lámpara, 12 mA; y ancho de hendidura, 0,2 nm. La cantidad de ion cobalto en las enzimas purificadas se calculó por extrapolación a partir de una curva estándar.

Los espectros UV-V se obtuvieron con un espectrofotómetro U-3900 (Hitachi, Tokio, Japón) a temperatura ambiente. Las enzimas se dializaron frente a KPB 10 mM (pH 7,5) y se prepararon muestras de 1,0 mg/ml.

Los parámetros cinéticos (Km, Vmax, kcat) de BAP14K y las proteínas de fusión se determinaron en KPB 10 mM a 25 °C y la concentración de enzimas fue de 0,2 mg/ml. Las concentraciones de 3-cianopiridina fueron 10, 20, 50, 100 y 200 mM y la reacción se terminó con acetonitrilo después de 2 minutos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software Graphpad Prism 5.

Para determinar la estabilidad térmica, incubamos las enzimas purificadas a 50 °C durante 40 minutos y medimos su actividad cada diez minutos. El método de determinación de la actividad fue como se mencionó anteriormente.

La tolerancia del producto estuvo representada por la disminución de 3-cianopiridina en presencia de nicotinamida 0,5 M y sin nicotinamida como control. Para comparar la tolerancia del producto de las recombinasas, determinamos la reducción de 3-cianopiridina en las mezclas con y sin nicotinamida.

El pH óptimo para la actividad enzimática se determinó realizando el ensayo en tampones de pH (KH2PO4, 3,893 g/l; C6H8O7·H2O, 6,008 g/l; H2BO3, 1,769 g/l; y Barbital-Na2, 5,266) (pH 6,0 a 11.0). El pH con mayor actividad se definió como el pH óptimo y la mayor actividad se tomó como 100%.

Los espectros de dicroísmo circular (CD) se recogieron utilizando un MOS-450/AF-CD-STP-A (Bio-Logic, Grenoble, Francia) con una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso óptico a una concentración de proteína de 0,2 mg/ml en KPB 10 mM. El espectropolarímetro y la lámpara de xenón se calentaron durante 30 minutos antes de los experimentos. Medimos la elipticidad entre 190 y 250 nm y se restó el espectro de un tampón blanco. Utilizamos un método en línea K2D3 en un servidor web de acceso público en http://k2d3.ogic.ca/ para predecir los tipos de estructuras secundarias. Este método mejora las predicciones, particularmente para el intervalo de longitud de onda entre 200 y 240 nm y para el contenido de cadenas beta42.

En un estudio anterior, el activador P14K podría existir con la subunidad α en forma de heterotrímero α (P14K) 2 y podría existir de manera estable cuando se agregara una etiqueta Strep al terminal N de P14K12. Como resultado, usamos pET24a-StrepP14K para preparar α(StrepP14K)2. La apoproteína se cultivó en ausencia de cobalto. A la inversa, la proteína que contiene cobalto se cultivó en presencia de cobalto. La apo-NHasa purificada (0,1 mg/ml) se mezcló con α(StrepP14K)2 que contenía cobalto purificado (0,8 mg/ml) seguido de incubación en KPB 10 mM (que contenía ditiotreitol 0,5 mM, pH 7,4) a 25 °C. . Como control, la apo-NHasa purificada se mezcló con ión cobalto (20 µM) de la misma manera.

Se usó un espectrómetro de masas MALDI-TOF (ultrafleXtreme, Bruker Daltonics) para determinar la masa molecular de la subunidad fusionada. Los espectrómetros de masas MALDI-TOF introducidos recientemente permiten la adquisición de espectros iónicos de fragmentos de alta calidad a partir de biomacromoléculas mediante fragmentación inducida por láser (LID). Primero se preparó la matriz (7,6 mg de 2,5-dihidroxiacetofenona diluidos en 375 μl de etanol y se agregaron 125 μl de solución de citrato de dihidrógeno amónico de 18 mg/ml) y 2 μl de matriz, 2 μl de solución de TFA al 2 % y 2 μl de muestra (5 mg/ml) se mezclaron. La solución de muestra se mezcló completamente usando puntas de pipeta hasta que se pudo observar la cristalización. La solución de muestra de 0,5 μl se colocó y se secó en una placa objetivo de acero inoxidable pulido. La cuantificación de las señales de masa se realizó mediante el software FlexAnalysis.

El tratamiento de la muestra sigue un protocolo de uso común43. En resumen, la solución de muestra se desnaturalizó primero en urea 8 M, con enlaces disulfuro reducidos por ditiotreitol y todos los residuos de cisteína fueron carboxamidometilados por yodoacetamida. A continuación, la muestra se limpió mediante diálisis y se digirió con TPCK-tripsina (Promega) en el tampón de digestión (bicarbonato de amonio 100 mM, pH 8,5). Los péptidos de la digestión se secaron completamente en un dispositivo SpeedVac (Thermo). A continuación, la muestra seca se volvió a disolver en la solución de muestra (2 % de acetonitrilo, 0,5 % de ácido fórmico y 97,5 % de agua). A continuación, se analizó una muestra de péptido disuelto mediante un sistema NanoLC-ESI-MS/MS.

El análisis NanoLC-ESI-MS/MS de muestras de proteínas digeridas se llevó a cabo mediante un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Agilent) con una columna C18 de fase inversa de 75 micrómetros de diámetro interior y 8 cm de longitud. El tiempo de inyección fue de 20 minutos. El Disolvente A de HPLC era 97,5 % de agua, 2 % de acetonitrilo y 0,5 % de ácido fórmico y el Disolvente B era 9,5 % de agua, 90 % de acetonitrilo y 0,5 % de ácido fórmico. El tiempo de gradación fue de 100 minutos desde el 2 % de disolvente B hasta el 90 % de disolvente B, más 20 minutos para la carga de la muestra y 20 minutos para el lavado de la columna. El caudal de la columna fue de aproximadamente 800 nanolitros por minuto después de la división. El volumen de inyección típico fue de 3 μl. El sistema de HPLC se acopló en línea con el espectrómetro de masas LTQ (Thermo) de manera que una muestra eluida de la columna de HPLC se ionizó directamente mediante un proceso de ionización por electropulverización (ESI) y entró en el espectrómetro de masas. El voltaje de ionización se optimizó cada vez y normalmente en un rango de 1,2 kV a 1,8 kV.

Cómo citar este artículo: Xia, Y. et al. Construcción de una nitrilo hidratasa de fusión de subunidades y descubrimiento de un innovador patrón de transferencia de iones metálicos. ciencia Rep. 6, 19183; doi: 10.1038/srep19183 (2016).

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Este trabajo cuenta con el apoyo financiero del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo de Alta Tecnología de China (Programa 863, 2014AA021304), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (JUSRP51411B), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31300087) y la Fundación de Ciencias Naturales de Jiangsu (BK20130131, BK20130139), un proyecto financiado por el desarrollo de programas académicos prioritarios de las instituciones de educación superior de Jiangsu, el proyecto 111 (No. 111-2-06), el desarrollo de la industria del "Centro de innovación colaborativo para la fermentación industrial avanzada" de la provincia de Jiangsu programa.

Laboratorio Clave de Biotecnología Industrial, Ministerio de Educación, Escuela de Biotecnología, Universidad de Jiangnan, Wuxi, 214122, China

Yuanyuan Xia, Wenjing Cui, Zhongmei Liu, Li Zhou, Youtian Cui y Zhemin Zhou

Instituto de Bioquímica Aplicada y Escuela de Graduados en Ciencias Ambientales y de la Vida, Universidad de Tsukuba, 1-1-1 Tennodai, Tsukuba, 305-8572, Ibaraki, Japón

Michihiko Kobayashi

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YX, WC, realizó la purificación de proteínas. YX, WC, ZL, LZ e YC realizaron las investigaciones enzimáticas in vitro e in vivo. YX, WC, XZ y RS, analizaron los datos y escribieron el manuscrito. MK y ZZ dirigieron la investigación. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Xia, Y., Cui, W., Liu, Z. et al. Construcción de una nitrilo hidratasa de fusión de subunidades y descubrimiento de un innovador patrón de transferencia de iones metálicos. Informe científico 6, 19183 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19183

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Recibido: 14 mayo 2015

Aceptado: 07 de diciembre de 2015

Publicado: 12 enero 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep19183

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