La activación de Cofilin 1 previene los defectos en la elongación y guía del axón inducidos por alfa extracelular

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 16524 (2015) Citar este artículo

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La neurogénesis adulta alterada y la lesión traumática del axón participan en la gravedad de las enfermedades neurodegenerativas. La alfa-sinucleína, una proteína citosólica implicada en la enfermedad de Parkinson, puede liberarse de las neuronas, lo que sugiere un papel del exceso de alfa-sinucleína secretada en el inicio y la propagación de la patología. Aquí proporcionamos evidencia de que la exposición a largo plazo de las neuronas jóvenes a la alfa-sinucleína extracelular dificulta el alargamiento del axón y el giro del cono de crecimiento. Mostramos que el recambio de actina y la tasa de movimiento de las ondas de actina a lo largo del axón están alterados, debido a la inactivación de cofilina inducida por alfa-sinucleína. Sin embargo, tras la disrupción de los microfilamentos por láser, la curación de los axones se ve favorecida por el aumento de la fosforilación de la cofilina en momentos posteriores; prevalece el defecto en la extensión de las neuritas, perdiéndose la regulación de la actividad de la cofilina. Es importante destacar que la sobreexpresión de la forma activa de cofilina en las neuronas expuestas a la alfa-sinucleína es capaz de restaurar el movimiento de las ondas de actina, la elongación fisiológica del axón y el giro del cono de crecimiento. Nuestro estudio revela la base molecular de los déficits impulsados ​​por la alfa-sinucleína en el crecimiento y la migración de las neuronas recién nacidas y en la elongación y regeneración de las neuronas adultas.

Las formas raras de la enfermedad de Parkinson (EP) que resultan de mutaciones de alfa-sinucleína (Syn) o una mayor expresión de Syn de tipo salvaje (wt) se caracterizan por un inicio temprano y una herencia autosómica dominante, lo que implica a Syn en la patogénesis de la enfermedad1,2 . Los niveles de sin también pueden tener un papel en la patogenia de la EP esporádica; Recientemente se identificaron polimorfismos de nucleótidos altamente asociados con la EP y que afectan los niveles de Syn al alterar la transcripción de genes o la estabilidad del ARNm3,4. La detección de syn en el líquido cefalorraquídeo y en el plasma5 abrió el campo al estudio de los mecanismos autónomos no celulares en la EP. Los injertos dopaminérgicos sanos implantados en el cuerpo estriado experimentan una degeneración acompañada de cuerpos de Lewy que contienen Syn, lo que sugiere un papel potencial del Syn extracelular secretado en la aparición del trastorno6,7. Un estudio muy reciente proporcionó evidencias de la transferencia de Syn desde una inoculación intraestriatal a las células receptoras, lo que lleva a la propagación de la patología a lo largo de los circuitos interneuronales8. Además del aumento en la expresión y liberación de Syn debido a la multiplicación del gen Syn, cualquier forma de lesión cerebral o muerte celular durante la neurodegeneración puede promover la liberación de Syn celular monomérico. En los modelos de EP de sobreexpresión de Syn, la pérdida de neuronas dopaminérgicas está precedida por cambios degenerativos en los axones y terminales del cuerpo estriado, lo que sugiere que la patología inducida por Syn afecta primero a los axones y terminales y que los cuerpos celulares están involucrados por un mecanismo de muerte regresiva. Las distintas etapas de la enfermedad pueden ser imitadas por el curso temporal de las alteraciones que ocurren en los animales tratados con Syn9.

Sin embargo, aún no se han investigado los déficits tempranos en el desarrollo y la funcionalidad neuronal provocados por la presencia de altos niveles de Syn extracelular.

La neurogénesis del adulto se ve afectada en el envejecimiento cerebral y en las enfermedades neurodegenerativas10,11, aumentando la gravedad de la patología por pérdida neuronal. Se ha encontrado una disminución en la neurogénesis del hipocampo tanto en pacientes con EP como en modelos animales con EP12,13,14. El alargamiento y la orientación del axón son procesos fundamentales para la correcta migración, integración y conectividad de las neuronas en desarrollo, procesos que están finamente ajustados por el recambio de actina y la actividad de las proteínas de unión a actina.

La interacción entre Syn y la actina fue sugerida por una colocalización observada en dos líneas de células neuronales15 y por la desregulación de los niveles de actina observada en modelos de PD de D. melanogaster y C. elegans16,17. Se demostró que Syn interactúa directamente con la actina in vitro y afecta la dinámica de la actina en células vivas y neuronas en cultivo18. Se descubrió que Syn monomérico extracelular en dosis altas, como la forma mutante A30P de Syn, altera la dinámica de la actina a través de la estabilización de microfilamentos mediada por la fosforilación de cofilina 119. Un equilibrio alterado de la actividad de la cofilina 1 debido a la desregulación de las quinasas y fosfatasas que controlan el estado de fosforilación de la cofilina 1 se ha asociado con la neurodegeneración. Se encontró un aumento en la inactivación/fosforilación de cofilina 1 con la edad y en la enfermedad de Alzheimer debido a la inactivación de las fosfatasas 120 de Slingshot. Se demostró que el péptido beta amiloide disminuye la fosforilación de cofilina en dosis bajas, promoviendo la formación de varillas de actina21 y que inactiva la cofilina a través de la quinasa del dominio LIM (LIMK) a dosis más altas, contribuyendo a la polimerización de actina22. La falta de serina/treonina-proteína quinasa repetida rica en leucina (LRRK), o la LRRK mutante incapaz de unirse a la proteína quinasa A (PKA), aumentó la fosforilación de cofilina dependiente de PKA, lo que lleva a una sinaptogénesis y transmisión anormales23.

Aquí mostramos que las neuronas del hipocampo en cultivo expuestas a wt extracelular o A30P mutante Syn tienen una elongación defectuosa del axón y un giro del cono de crecimiento romo, mientras que el recambio de actina disminuye y la actividad de la cofilina 1 está alterada. Todos los defectos asociados con el citoesqueleto en el desarrollo axonal inducidos por Syns pueden prevenirse mediante la activación de la cofilina 1. Proponemos un mecanismo mediante el cual el cableado preciso de las redes neuronales, tanto en las neuronas en desarrollo en las áreas de neurogénesis adulta como en las conexiones maduras establecidas, se pierde en etapas tempranas durante la neurodegeneración inducida por Syn. Por lo tanto, las vías reguladoras de la cofilina 1 podrían constituir un objetivo eficaz para la terapia de la EP.

Anteriormente mostramos que Syn modula fisiológicamente el ensamblaje de actina, una actividad que está profundamente alterada en el mutante Syn A30P18 y que los altos niveles de Syns extracelulares solubles, tanto en forma wt como mutante A30P, también pudieron afectar la dinámica de la actina, estabilizando los microfilamentos19. Para evaluar el efecto crónico de Syns presente en el medio extracelular, incubamos neuronas hipocampales embrionarias inmediatamente después de la disección con 5 μM de wt recombinante humano purificado o A30P Syn durante 2 días. Las proteínas purificadas no contenían formas agregadas o escindidas y mostraron la presencia de pocos oligómeros después de 2 días de incubación con el medio neuronal24. En comparación con las muestras de control, en las neuronas a los 2 días in vitro (DIV) expuestas a Syns extracelular fue evidente un aumento en los filopodios y los lamelipodios alrededor del cuerpo celular y el cono de crecimiento (Fig. 1a), lo que indica un mayor ensamblaje y estabilización de la actina.

Los Syns extracelulares disminuyen la fracción móvil de actina.

( a ) Distribución de actina F, según lo revelado por la tinción con faloidina fluorescente, en 2 neuronas hipocampales embrionarias de ratón DIV incubadas en ausencia o presencia de wt purificado 5 μM o A30P Syn durante 2 días. (b) Las neuronas infectadas con actina-YFP se blanquearon a lo largo del axón (panel izquierdo, cuadrado) y se tomaron imágenes a 3 DIV a 1 fotograma/0,6 s durante 60 s (panel derecho). ( c ) Curvas medias de recuperación de fluorescencia de actina-YFP después del fotoblanqueo a lo largo del tiempo en neuronas tratadas con control (azul), wt Syn (verde) y A30P Syn (rojo), observe el valor más bajo de la meseta en las curvas obtenidas de Syns- neuronas tratadas. (d) Evaluación cuantitativa del porcentaje de fracción móvil sobre la fluorescencia total y de la constante de tiempo de recuperación de la fluorescencia (e) en control y en neuronas tratadas con Syns como en (a). En (d, e) los datos se expresan como valores medios ± SEM. En (c–e), ctrl, n = 19, wt Syn, n = 24; A30P Syn, n = 24, de 3 cultivos independientes. Significación estadística determinada por ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para comparación múltiple, *P < 0,05; ** P < 0,01. (d) P = 0,0046, valor alfa: 0,050:0,791; (e) P = 0,5170 ns, valor alfa: 0,050:0,049). Barras en (a, b) 10 μm.

Para comprender si el efecto observado de Syns extracelulares en la morfología y la dinámica del citoesqueleto podría deberse a un aumento en los microfilamentos estabilizados, realizamos experimentos de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). FRAP se realizó en neuronas en 3 DIV viralmente infectadas con actina-YFP. La región de interés (ROI) se eligió en el centro del axón a la misma distancia del cuerpo celular en todas las neuronas examinadas (Fig. 1b). La recuperación de la intensidad de la fluorescencia después del fotoblanqueo se cuantificó después de la normalización en un área de control. La constante de tiempo de la recuperación de la fluorescencia se correlaciona con la velocidad de polimerización de la actina y la meseta alcanzada por la fluorescencia indica la fracción de filamentos que se someten a una cinta de correr activa (Fig. 1c). La cuantificación de estos parámetros mostró que en las neuronas tratadas con Syns, la fracción móvil disminuyó en ~ 35% con respecto al control (Fig. 1d), aunque la tasa de inserción no cambió (Fig. 1e). Estos resultados sugieren que el grupo de monómeros de actina libres es bajo y el equilibrio se desplaza hacia un estado polimerizado estable de microfilamentos.

Tanto la interrupción como la estabilización del citoesqueleto de actina pueden provocar la incapacidad de los axones para alargarse y girar en respuesta a señales extracelulares. La cámara de quimiotaxis de Dunn se utilizó para estudiar la respuesta de las neuronas a un gradiente de quimioatrayentes, el pocillo exterior contenía una solución de 20 μM de 8-Bromoadenosina 3′,5′-monofosfato cíclico (8-Br-cAMP), un activador de la PKA ( Figura 2a). Las neuronas se incubaron sin o con wt y A30P Syn durante 2 días antes de los experimentos y se examinaron para determinar su respuesta a 8-br-cAMP mediante imágenes de lapso de tiempo durante 30 min. El análisis de la dirección del giro del axón en presencia de la señal atrayente mostró que, mientras que las neuronas de control cambiaron su trayectoria de crecimiento en la dirección de concentraciones crecientes de quimioatrayente, las neuronas tratadas con Syns perdieron la capacidad de seguir las señales de guía (Fig. 2b ). La cuantificación de la dirección de crecimiento de los axones después de 30 min de la aplicación de 8-Br-cAMP indica una respuesta positiva del 100 % en las neuronas de control y una respuesta positiva del 50 % en las neuronas tratadas con Syns, lo que es indicativo de un comportamiento aleatorio (Fig. 2c). La tasa de crecimiento de los axones giratorios también disminuyó significativamente en las neuronas tratadas con wt y A30P Syn (Fig. 2d). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la disminución del recambio de actina impulsada por Syns podría correlacionarse con déficits funcionales en las neuronas en desarrollo, como el alargamiento y la migración correcta del axón.

Los Syns extracelulares dificultan la guía del axón.

(a) Neuronas cultivadas en un cubreobjetos montado boca abajo sobre una cámara de Dunn con el pocillo exterior lleno de 8-br-cAMP cíclico 40 μM que forma un gradiente por difusión. Se tomaron imágenes de las neuronas a 1 fotograma/min durante 30 min, las imágenes se muestran a los 0 min ya los 30 min desde la aplicación del gradiente (barra gris en la parte superior). ( b ) Gráficos de trayectoria de axones en crecimiento expuestos a un gradiente de señal atrayente durante los 30 minutos del experimento en neuronas tratadas con ctrl, wt y A30P Syn a 2 DIV. La fuente de quimioatrayente está en la parte superior de las parcelas. La dirección inicial del axón estaba alineada con el eje horizontal. ( c ) Evaluación cuantitativa del porcentaje de axones que giran hacia el gradiente de atracción en las neuronas tratadas como en ( b ). Los datos de las neuronas de cada experimento se agruparon y se realizó un análisis estadístico comparando los datos de experimentos independientes. ( d ) Evaluación cuantitativa de la elongación del axón durante 30 min en neuronas tratadas con o sin wt o A30P Syn. En (c, d) los datos se expresan como valores medios ± SEM. En (c), ctrl, n = 30; peso Syn, n = 17; A30P Syn, n = 18, de 3 cultivos independientes. En d ctrl, n = 20; peso Syn, n = 14; A30P Syn, n = 12, de 3 cultivos independientes. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para comparación múltiple, *P < 0,05; *** P < 0,001. (c) P = 0,0001, valor alfa: 0,050:1,000; (d) P = 0,0424, valor alfa: 0,050:0,450) Barra en a: 10 μm.

En las neuronas en crecimiento, las ondas de actina viajan desde el cuerpo celular hasta el cono de crecimiento para facilitar el crecimiento del axón. Utilizamos la velocidad de las ondas de actina como parámetro de la dinámica de las neuritas; de hecho, las ondas de actina son más frecuentes y más rápidas en las neuronas en DIV temprano. Durante las imágenes de lapso de tiempo de las neuronas a 2 DIV, las estructuras en forma de cono de crecimiento que viajaban desde el cuerpo celular hasta la punta del axón eran claramente visibles (Fig. 3a). Las ondas de actina contenían actina y cofilina 1, una proteína de unión a actina, mientras que los microtúbulos, que están presentes en el centro del axón, estaban ausentes de las ondas de actina (Fig. 3b). Se tomaron imágenes de las neuronas incubadas con o sin Syns a 1 fotograma/2 min y se determinó la velocidad de las ondas de actina calculando el tiempo que tarda la onda en llegar a la punta del cono de crecimiento, normalizado para la longitud del axón (Video complementario 1) . En comparación con las muestras de control, las neuronas expuestas a Syns extracelulares durante 2 días mostraron una disminución de ~20% en la velocidad de las ondas de actina (Fig. 3c), aunque se veían saludables y exhibían conos de crecimiento dinámico. Anteriormente mostramos que los Syns extracelulares actúan indirectamente sobre la dinámica de la actina a través de la inactivación de la cofilina 1, promoviendo la estabilización de los filamentos de actina19. Por lo tanto, nos preguntamos si la cofilina 1 estaba en su estado inactivo después de la exposición crónica a Syns. Las neuronas se expusieron a Syns durante 2 días y el nivel de cofilina 1 inactiva fosforilada se cuantificó mediante inmunotransferencia (Fig. 3d). De hecho, el nivel de cofilina 1 fosforilada aumentó 1,8 veces en las neuronas incubadas con wt Syn y 2 veces en las neuronas incubadas con A30P Syn en comparación con el control (Fig. 3e). El estudio de localización de cofilina 1 inactiva se realizó sustrayendo las áreas inmunofluorescentes de fosfo-cofilina 1 de las áreas teñidas por cofilina 1 fluorescente en neuronas tratadas o no con Syns durante 2 días (fig. 3f). Las imágenes de sustracción revelaron áreas de fosfo-cofilina 1 enriquecida donde la tinción estaba ausente y, en particular, las ondas de actina no mostraron tinción en las neuronas tratadas con Syns (Fig. 3f, paneles medio e inferior, flechas), lo que sugiere que, a través de la inactivación de cofilina 1, El citoesqueleto de actina perdió su dinámica dentro de las ondas de actina. Para evaluar aún más la correlación entre la velocidad de las ondas de actina y el estado de polimerización del citoesqueleto, utilizamos fármacos que modulan el ensamblaje de la actina. Las neuronas se expusieron a Jasplakinolide (Jaspla), un estabilizador de microfilamentos y a Latrunculin A (LatA), una proteína secuestradora de monómeros, durante 20 min, los fármacos se eliminaron por lavado y se tomaron imágenes de las neuronas durante 3 h. De hecho, después del tratamiento con Jaspla, la velocidad de las ondas de actina se redujo en un 20 %, de forma similar al efecto Syn y tras el tratamiento con LatA, la velocidad de las ondas de actina fue mayor (Fig. 3g), lo que sugiere que la despolimerización rompe el movimiento de las ondas de actina.

En presencia de Syns, las ondas de actina se mueven más lentamente y contienen una mayor concentración de p-cofilina 1.

( a ) Imágenes de lapso de tiempo de una neurona hipocampal embrionaria de 2 DIV que muestra una onda de actina que procede del cuerpo celular al cono de crecimiento. Se tomaron imágenes de las neuronas a 1 fotograma cada 2 min durante 3 h. ( b ) Análisis de fluorescencia de la neurona en 2 DIV teñida con faloidina (actina F) y anticuerpos contra la tubulina y la cofilina 1. La actina y la cofilina 1 están presentes en la onda (flechas) mientras que la tubulina está excluida. ( c ) Cuantificación de la velocidad de las ondas de actina calculada en neuronas tratadas con o sin wt o A30P Syn durante 2 días y con imágenes como en ( a ). ( d ) Inmunotransferencias representativas que muestran los niveles de proteínas indicados a la derecha en homogeneizados celulares de neuronas tratadas con o sin wt o A30P Syn. La actina se muestra como patrón interno. ( e ) Cuantificación de la relación entre las bandas de p-cofilina 1 y cofilina 1, analizada por densitometría y normalizada en el nivel de actina, para cada condición experimental que se muestra en ( d ). (f) Análisis de fluorescencia de neuronas incubadas durante 2 días con o sin wt o A30P Syn y procesadas para cofilina 1 y p-cofilina 1. En los paneles de la derecha se muestran imágenes derivadas de la resta del área teñida para p-cofilina 1 de el área teñida para cofilina 1. ( g ) Cuantificación de la velocidad de las ondas de actina calculada en neuronas tratadas con o sin 2 μM LatA durante 20 min o 12 nM Jaspla durante 20 min. En (c, e, g) los datos se expresan como valores medios ± SEM. En c, ctrl, n = 59; peso Syn, n = 60; A30P Syn, n = 76, de 5 cultivos independientes. En (e), n = 3 experimentos independientes. En (g), ctrl, n = 74; LatA, n = 20; Jaspla, n = 23, de 3 culturas independientes. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para comparación múltiple, *P < 0,05; ** P < 0,01. (c) P = 0,0012, valor alfa: 0,050:0,890; (e) P = 0,0086, valor alfa: 0,050:0,477; (g) P = 0,0012, valor alfa: 0,050:0,897). Barras en (a, f) 10 μm, en (b) fila superior, 10 μm, fila inferior, 2 μm.

El traumatismo craneoencefálico y la lesión de las neuronas es una condición que profundiza los síntomas de la EP. El citoesqueleto de actina está involucrado en la reparación y regeneración de los axones lesionados, por lo que nos preguntamos si Syns interferiría con el proceso de curación. Se utilizó un láser UVA pulsado en subnanosegundos para crear una lesión parcial de los axones de una manera altamente controlada y reproducible. La baja potencia del láser (1,8 μW) indujo el adelgazamiento del axón sin la ablación completa de la membrana neuronal (Fig. 4a, mancha roja y video complementario 2) y una interrupción localizada de los tres elementos del citoesqueleto axonal25. El axón y el cono de crecimiento que se encogieron después de la lesión volvieron a su forma original en poco tiempo y en pocos minutos las ondas de actina comenzaron a moverse sobre la lesión y se dirigieron al cono de crecimiento (Video complementario 3). La velocidad de onda en estado estacionario en ausencia o presencia de Syns se usó para comparar la dinámica en neuronas lesionadas y no lesionadas.

Los syns favorecen el movimiento de las ondas de actina después de una lesión axonal.

(a) Neurona a 2 DIV antes (panel izquierdo) y después (panel central) de la lesión por láser UVA (mancha roja). En los paneles de la derecha se muestra una ampliación del área lesionada antes (superior) y después (inferior) de la lesión. ( b ) Cuantificación de la velocidad de las ondas de actina en neuronas lesionadas tratadas con o sin wt o A30P Syn durante 2 días y con imágenes como en la Fig. 3a. ( c ) Análisis de fluorescencia (pila Z de imágenes confocales) de neuronas embrionarias del hipocampo antes (paneles de la izquierda), después de 20 min de 2 μM LatA (paneles del medio) y después de 2 h de lavado del fármaco (paneles de la derecha) y teñido con faloidina (F-actina) (rojo) y anticuerpos contra cofilina 1 (azul) y p-cofilina 1 (verde). ( d ) Cuantificación de la relación entre la intensidad de fluorescencia de p-cofilina 1 y cofilina 1, para cada condición experimental que se muestra en ( c ). ( e ) Inmunotransferencias representativas que muestran los niveles de proteínas indicados a la derecha en homogeneizados celulares de neuronas tratadas con o sin LatA 2 μM durante 20 min y después de 2 h de lavado del fármaco. La actina se muestra como patrón interno. ( f ) Cuantificación de la relación entre las bandas de p-cofilina 1 y cofilina 1, analizadas por densitometría, para cada condición experimental que se muestra en e. ( g ) Cuantificación de la elongación del axón durante 16 h en neuronas tratadas con o sin wt o A30P Syn durante 2 días y lesionadas por láser UVA. En (b, d, f, g) los datos se expresan como valores medios ± SEM. En (b), ctrl, n = 30; peso Syn, n = 35; A30P Syn, n = 32, de 3 cultivos independientes. En (d), n = 5 para cada condición de 3 cultivos independientes. En (f), n = 3 experimentos independientes. En (g), ctrl, n = 25; peso Syn, n = 18; A30P Syn, n = 13, de 4 cultivos independientes. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para comparación múltiple, *P < 0,05; ** P < 0,01. (b) P = 0,2956, ns, valor alfa: 0,050:0,083; (d) P = 0,0043, valor alfa: 0,050:0,942; (f) P = 0,0316, valor alfa: 0,050:0,683; (g) P = 0,0141, valor alfa: 0,050:0,659). Barras en (a) panel central, 10 μm, panel derecho, 1 μm, en (c) 20 μm.

En las neuronas de control, la lesión indujo una ligera disminución de la velocidad de las ondas de actina. Inesperadamente, en las neuronas tratadas con wt y A30P Syn, la velocidad de las ondas de actina después de la lesión fue similar al control (Fig. 4b), sin embargo, significativamente mayor con respecto a la velocidad de las ondas de actina en las neuronas tratadas con Syns, no lesionadas (Fig. 3c ). Es concebible que, en una condición en la que la actina se vuelve resistente a la despolimerización y los microfilamentos se estabilizan, como ocurre en presencia de Syns, el grupo de monómeros de actina necesarios para la marcha de los filamentos activos es pobre, lo que lleva a un movimiento lento de las ondas de actina. En caso de ruptura local de los microfilamentos, como después de una lesión, la reserva de monómeros se restaura localmente favoreciendo la polimerización activa.

Para verificar esta hipótesis tratamos neuronas con LatA. LatA, que induce la despolimerización de actina, podría representar una condición que simula una lesión, aunque no localizada, pero que involucra a todo el axón. Mostramos que la velocidad de las ondas de actina fue mayor con el tratamiento con LatA (Fig. 3g) y preguntamos cuál podría ser el objetivo común para Syns y LatA que puede favorecer el proceso de curación. Una despolimerización generalizada, como la inducida por LatA, posiblemente podría activar un mecanismo de retroalimentación en las células, dirigido al rescate de la morfología de los microfilamentos. Cuando se aplicó LatA a las neuronas durante 20 min, se observó un aumento en el nivel de cofilina 1 fosforilada, que volvió a las condiciones de control después de 2 h desde el lavado del fármaco, evidente en la inmunotinción (Fig. 4c, d) y en la inmunotransferencia de p-cofilina 1 (Fig. 4e, f). La inactivación de la cofilina 1, que favorecerá la polimerización de los microfilamentos, explicaría el aumento de la velocidad de las ondas de actina en presencia del fármaco, y del mismo modo, en presencia de Syns tras la despolimerización de los microfilamentos por la lesión inducida por láser . El efecto protector agudo de Syns debido a la inactivación de la cofilina 1 no excluyó una posible alteración en el alargamiento del axón después de la lesión en momentos posteriores. Las neuronas se incubaron con Syns después de la siembra, a 2 DIV, el axón se lesionó como se indicó anteriormente y se tomaron imágenes de las neuronas durante 16 h. Se trazó el axón y se calculó el aumento de longitud entre el primer y el último fotograma de la película (Fig. 4g). De hecho, después de la lesión y en presencia de Syns, la elongación fue un 30 % menor que en el control, lo que indica que, aunque la inactivación crónica de la cofilina 1 podría favorecer transitoriamente la repolimerización de los filamentos rotos, perjudica la regeneración del axón en momentos posteriores.

Para correlacionar el estado de fosforilación de cofilina 1 y, por lo tanto, la estabilización del citoesqueleto, con la disminución de la velocidad de las ondas de actina impulsada por Syn, utilizamos construcciones de cofilina 1 negativas y positivas dominantes. Las neuronas se sometieron a electroporación con cofilina 1 de tipo salvaje, o la forma mutante S3A no fosforilable de cofilina 1, que es constitutivamente activa, o el mutante pseudofosforilado S3E, que es constitutivamente inactivo. Las neuronas sometidas a electroporación con construcciones de cofilina 1 etiquetadas con RFP expresaron la proteína exógena (Fig. 5a, RFP-cofilina) en un promedio de 2 a 4 veces el nivel de cofilina 1 endógena, según lo calculado considerando la eficiencia de transfección, que fue ~30%-40 % La sobreexpresión de cofilina 1 S3A indujo ondas significativamente más rápidas y lo contrario sucedió en las neuronas que sobreexpresan cofilina 1 S3E (Fig. 5b), lo que indica la importancia de la modulación de cofilina 1 para promover la motilidad de la onda de actina. Es importante destacar que la sobreexpresión de S3A cofilina 1 en neuronas expuestas a Syns pudo restaurar la velocidad de movimiento de las ondas de actina (Fig. 5c), equilibrando la inactivación de la proteína impulsada por Syn.

La cofilina 1 activa previene los defectos impulsados ​​por Syn en la elongación y el giro del axón.

(a) Inmunotransferencias que muestran las proteínas indicadas a la derecha en homogeneizados de neuronas sometidas a electroporación con cofilina RFP-wt, cofilina RFP-S3A, cofilina RFP-S3E o RFP como control. ( b ) Cuantificación de la velocidad de las ondas de actina en neuronas electroporadas con construcciones como en ( a ). ( c ) Cuantificación de la velocidad de las ondas de actina en neuronas electroporadas con cofilina RFP o RFP-S3A e incubadas en ausencia o presencia de wt o A30P Syn durante 2 días. ( d ) Cuantificación de la elongación del axón durante 30 min en neuronas electroporadas con cofilina RFP o RFP-S3A y tratadas con o sin wt o A30P Syn. ( e ) Cuantificación del porcentaje de axones que giran hacia el gradiente de atracción en neuronas electroporadas y tratadas como en ( d ). Los datos de las neuronas de cada experimento se agruparon y se realizó un análisis estadístico comparando los datos de experimentos independientes. En (b-e) los datos se expresan como valores medios ± SEM. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de dos colas. En (b), RFP/S3A, P = 0,0176, valor alfa: 0,050:0,747; RFP/S3E, P = 0,0381, valor alfa: 0,050:0,273; solicitud de propuesta, n = 41; cofilina en peso, n = 13; S3A, n = 43; S3E, n = 11, de 3 cultivos independientes. En c, RFP/wt Syn, P = 0,0226, valor alfa: 0,050:0,547; RFP/A30P Syn P = 0,0191, valor alfa: 0,050:0,181; wt Syn/S3A + wt Syn P = 0,0291, valor alfa: 0,050:0,604; A30P Syn/S3A + A30P Syn, P = 0,0135, valor alfa: 0,050:0,421; solicitud de propuesta, n = 43; peso Syn, n = 17; A30P Sín, n = 20; S3A + peso Sin, n = 14; S3A + A30P Syn, n = 27, de 3 cultivos independientes. En d, RFP/wt Syn P = 0,0231, valor alfa: 0,050:0,634; RFP/A30P Syn P = 0,0282, valor alfa: 0,050:0,602; wt Syn/S3A + wt Syn, P = 0,0035, valor alfa: 0,050:0,884; A30P Syn/S3A + A30P Syn, P = 0,0426, valor alfa: 0,050:0,540; solicitud de propuesta, n = 33; peso Syn, n = 13; A30P Sín, n = 13; S3A + peso Sin, n = 9; S3A + A30P Syn, n = 10, de 3 cultivos independientes. En e, la significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para comparación múltiple, ***P < 0,001, (RFP/wt Syn, RFP/A30P Syn, P = 0,0001, valor alfa: 0,050:1,000) y mediante prueba t de dos colas: wt Syn/S3A + wt Syn P = 0,0012, valor alfa: 0,050:0,874; A30P Syn/S3A + A30P Syn, P = 0,0044, valor alfa: 0,050:0,688; solicitud de propuesta, n = 43; peso Syn, n = 17; A30P Sín, n = 20; S3A + peso Sin, n = 14; S3A + A30P Syn, n = 27, de 3 cultivos independientes.

Sobre la base de estos resultados y para correlacionar la tasa de movimiento de las ondas de actina con el alargamiento axonal, probamos la capacidad de la cofilina 1 constitutivamente activa para prevenir los defectos en la tasa de crecimiento axonal. Se tomaron imágenes de las neuronas electroporadas con cofilina 1 S3A y expuestas durante 2 días a Syns como se indicó anteriormente y se calculó la longitud del axón después de 30 min. La exposición de neuronas transfectadas simuladamente a wt y A30P Syn indujo una disminución significativa en el alargamiento de los axones como se observó en las neuronas no transfectadas (Fig. 2d), la expresión de cofilina 1 activa pudo restaurar la tasa de crecimiento fisiológico en presencia de Sin (Fig. 5d).

Además, para confirmar la correlación entre el efecto de Syn en la actividad de la cofilina, la alteración resultante de la dinámica del citoesqueleto y el giro del cono de crecimiento, evaluamos la capacidad de la cofilina 1 activa para restaurar la respuesta del axón a las señales atrayentes, que se perdió en el presencia de Syns extracelulares. Las neuronas transfectadas de forma simulada o que expresaban cofilina 1 S3A se analizaron en la cámara de Dunn tras la creación de un gradiente de 8-Br-AMPc. Si bien solo el 50% de las neuronas que expresan RFP incubadas con Syns se volvieron aleatoriamente hacia la señal atrayente, la expresión de S3A cofilina 1 restableció la respuesta correcta y el 80-100% de los axones pudieron girar siguiendo el gradiente (Fig. 5e).

En conjunto, estos resultados indican la posibilidad de evitar que el efecto Syn actúe sobre su proteína objetivo cofilina 1 y restablecer la capacidad de las neuronas para alargarse y migrar hacia su objetivo.

En este estudio proporcionamos evidencia de que el Syn liberado extracelularmente contribuye a los déficits en la elongación y guía del axón que subyacen al deterioro en el desarrollo neuronal y la regeneración después de una lesión, participando en la gravedad de las enfermedades neurodegenerativas, como la EP.

Anteriormente demostramos que la dinámica de la actina se ve afectada por la presencia de un exceso de wt o A30P Syn en el medio extracelular, lo que resulta en la estabilización del microfilamento19. Aquí, mostramos que la exposición a largo plazo de las neuronas a Syns extracelulares se correlaciona con una disminución del recambio de actina, indicado por el bajo porcentaje de actina móvil a lo largo del axón. Las neuronas aparecieron enriquecidas en estructuras de actina, con grandes lamellipodia alrededor del cuerpo celular y en la punta de la neurita, que recuerdan el efecto inducido por las drogas estabilizadoras de actina.

Las multiplicaciones del gen que codifica Syn ocurren en la aparición temprana de PD2, 26, 27 y, consistentemente, altas concentraciones de Syn wt actuaban de manera similar a Syn mutado A30P, lo que confirma el papel patológico de un exceso de proteína wt. Curiosamente, la vulnerabilidad selectiva de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra con respecto a las neuronas del área tegmental ventral puede correlacionarse con los niveles aumentados de Syn que se encuentran en estas neuronas en monos ancianos y humanos28.

La lesión axonal, una causa subyacente de los trastornos neurodegenerativos, desencadena cambios en la expresión génica, complejos de proteínas y relocalización de proteínas. El enriquecimiento de syn en los axones dañados29 sugiere un posible papel en la búsqueda de caminos de brotación regenerativa y cono de crecimiento. La dinámica de la actina es necesaria para la guía del axón y el crecimiento del axón no guiado se produce en ausencia de ensamblaje de actina30. La disrupción regional de actina induce al cono de crecimiento a alejarse de esta región y crecer en la dirección que contiene filopodios estabilizados31.

Informamos que la exposición crónica a Syns extracelular ralentiza el alargamiento axonal tanto durante el crecimiento fisiológico como durante el nuevo crecimiento después de la lesión. Encontramos que la velocidad de las ondas de actina, utilizada como parámetro de la dinamicidad de las neuritas32, se correlacionaba con la extensión del axón y disminuía en presencia de Syns. Se demostró que las ondas de actina contenían actina y cofilina 1, mientras que el tratamiento con Syns indujo la acumulación de cofilina 1 fosforilada en las ondas de actina. De forma consistente, la velocidad de las ondas de actina aumentó en presencia del fármaco despolimerizante de actina, LatA, y disminuyó en presencia del fármaco estabilizador de actina, Jaspla. Después de la lesión axonal, los microfilamentos se interrumpieron parcialmente, como se mostró en nuestros resultados previos25 y un cambio de la dinámica de la actina hacia la polimerización favoreció la cicatrización de la lesión, de hecho, la velocidad de las ondas de actina en presencia de Syns fue mayor que antes de la lesión. Sin embargo, en puntos de tiempo posteriores, la regeneración del axón se vio obstaculizada por la disminución del recambio de actina debido a la presencia de Syn. La correlación entre la actividad de cofilina 1 y la velocidad de las ondas de actina se evaluó con el uso de LatA. En una condición de despolimerización de microfilamentos inducida por LatA, similar a la situación en el axón lesionado, la velocidad de las ondas de actina aumentó y la cofilina 1 se inactivó como mecanismo de retroalimentación. Después del lavado de LatA, la cofilina 1 se desfosforiló a la condición de control, restaurando su actividad para equilibrar la dinámica de la actina, mientras que en presencia de Syns, la cofilina 1 permaneció crónicamente inactiva.

Cofilin 1, una proteína de corte de actina, mantiene el conjunto de monómeros de actina y, por lo tanto, remodela los filamentos de actina al mejorar la dinámica de ensamblaje/desensamblaje33. La fosforilación de cofilina 1 en un residuo de serina3 conservado por múltiples quinasas, incluida LIMK, conduce a la inhibición de su actividad despolimerizante de actina34,35. La actividad de la cofilina 1 está implicada en la extensión del axón y la motilidad del cono de crecimiento36,37,38 y en las neuronas de la retina, la cofilina 1 actúa como diana del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en la modulación de la dinámica filopodial39,40.

Además, recientemente se demostró un papel de la cofilina en la guía del cono de crecimiento en respuesta a las proteínas morfogénicas óseas en las neuronas espinales de Xenopus laevis41 y se demostró que el factor de crecimiento nervioso (NGF) y la netrina-1 estimulan la protrusión de la membrana plasmática en el cono de crecimiento, mientras aumentan la cofilina activa. . Los aumentos locales en la cofilina activa indujeron el giro atractivo y la actividad reducida de la cofilina anuló el giro hacia NGF o netrina-142.

Anteriormente mostramos que Syns inducía la inactivación de la cofilina 1 a través de la vía Rac1/LIMK desencadenada por la acumulación de proteína relacionada con la glucosa de 78 kDa (GRP78) en la superficie externa de la membrana plasmática. Aquí proporcionamos evidencia de que Syn, presente durante 2 días en el medio neuronal, mantuvo una fosforilación crónica de cofilina 1 y que en estas neuronas se perdió la respuesta del cono de crecimiento a las señales atrayentes. De hecho, la expresión de cofilina 1 activa en las neuronas pudo restaurar el giro atractivo del cono de crecimiento. De manera consistente, la expresión de cofilina 1 activa también previno los déficits en la elongación del axón y en la tasa de movimiento de las ondas de actina inducidas por Syns, lo que indica que la cofilina 1 es el objetivo principal de la actividad patológica de Syns durante el desarrollo de las neuronas recién nacidas y la regeneración de las neuronas lesionadas. El aumento de la muerte celular y la reducción de la supervivencia de las neuronas recién nacidas en animales transgénicos Syn pueden deberse a defectos en el crecimiento y la integración sináptica y se ha demostrado la toxicidad de una cantidad creciente de Syn para ejercer estos efectos patológicos12.

Además, la conexión entre la actividad de la cofilina 1 y las neurotrofinas, que también restauraron el número y la velocidad de movimiento de las ondas de actina25, refuerza el uso de las neurotrofinas como diana terapéutica en el tratamiento de la EP y las sinnucleopatías relacionadas.

Todos los reactivos químicos se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) y GE Healthcare (Uppsala, Suecia). Las placas de Petri con fondo de vidrio eran de Mattek Corp (Ashland, MA) y la cámara de Dunn era de Hawksley (Lancing, Reino Unido).

Anticuerpos monoclonales de ratón: anti-actina (Sigma Aldrich); anticofilina 1 (Abcam, Cambridge, MA). Anticuerpos policlonales de conejo: cofilina 1 antifosforilada (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-b-tubulina III (Covance, Emervylle, CA).

Los anticuerpos secundarios Alexa Fluor conjugados con fluorescencia eran de Molecular Probes (Eugene, OR); anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Bio-Rad, Hercules, CA); Faloidina conjugada con FITC (Molecular Probes-Life Technologies, Carlsbad, CA).

Los ADN de cofilina humana pmRFP-N1 wt (número de catálogo 50856), cofilina humana pmRFP-N1 S3A (número de catálogo 50857) y cofilina humana pmRFP-N1 S3E (número de catálogo 50858) (Addgene (Cambridge, MA) fueron un regalo de James Bamburg .

Las construcciones que codifican el wt de longitud completa humana o A30P Syn insertado en el plásmido pET21d fueron un amable obsequio del Dr. Brett Lauring (Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.). Las bacterias se indujeron durante la fase exponencial con isopropil-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM durante 2 hy se recolectaron mediante centrifugación. El sedimento se solubilizó en Tampón A (HEPES/KOH 20 mM, pH 7,2 y KCl 100 mM) y se calentó durante 5 min a 90 °C. El lisado celular se centrifugó a 72 000 × g durante 30 min y el sobrenadante se cargó en una columna Syn de HiTrap monoQ y se eluyó con un gradiente lineal de KCl de 100 a 500 mM y las fracciones de interés se concentraron usando un filtro centrífugo Centricon antes cargando en una columna Superose 12 en Tampón A. Las fracciones que contenían Syn se agruparon, concentraron y almacenaron a -80 °C. Para controlar la pureza de Syn, se cargó 1 mg de Syn purificado en la parte superior de una columna Superdex 75 10/300 (GE Healthcare) y se eluyó a 0,5 ml/min en un aparato Purificador AKTA. La densidad óptica (OD) se midió continuamente a 280 nm y 50 ng de Syn purificado se cargaron en un gel SDS-PAGE y se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue.

Los cultivos neuronales primarios se obtuvieron de hipocampos diseccionados de ratones C57BL/6S E 18 (Harlan, Udine, Italia). Los animales se mantuvieron en una instalación para animales libre de patógenos. Todos los experimentos se realizaron en estricta conformidad con los procedimientos experimentales aprobados por el Ministerio de Salud italiano.

Los embriones fueron extraídos y disecados en condiciones estériles. Los hipocampos se disociaron por digestión enzimática en tripsina (0,125 % durante 30 min a 37 °C). La actividad de la tripsina se bloqueó añadiendo medio completo (NeurobasalTM (Gibco) suplementado con B27 (2%, Gibco), alanil-glutamina (2 mM, Gibco), penicilina/estreptomicina (ambas 1 mM, Sigma) que contenían suero bovino fetal al 10% ( FBS, Gibco). Después de la tripsinización, los tejidos se enjuagaron en medio completo sin FBS y se disociaron con una pipeta de plástico. Las neuronas se sembraron en placas de Petri con fondo de vidrio para obtener imágenes a largo plazo (densidad de 20 000 neuronas en un fondo de vidrio de 10 mm de diámetro) ; o en cubreobjetos de vidrio para inmunocitoquímica (densidad de 30 000 neuronas en cubreobjetos de 18 mm de diámetro); o en cubreobjetos de vidrio (cuadrado #3D) para ensayo de quimiotaxia (densidad de 50 000 neuronas en cubreobjetos de 20 × 26 mm); o en multipocillos Petri de plástico Placas para inmunotransferencia (densidad de 350.000 neuronas en placa de 30 mm de diámetro) Después de 2 horas desde la siembra, se añadieron 2 ml de medio acondicionado glial sin suero.

Se disecaron cortezas de ratones E18 y se colocaron en HBSS frío y luego se incubaron en tripsina al 0,125 % + 1 mg/ml de ADNsa durante 15 min a temperatura ambiente, se almacenó el sobrenadante y se repitió la incubación en tripsina. Se agruparon dos sobrenadantes y se centrifugaron durante 5 min a 1500 rpm a 8 °C. Las células se resuspendieron en MEM + suero de caballo al 10 %, Pen/Strep, glucosa 33 mM y glutamina 2 mM. Las células gliales se sembraron en matraces T75 recubiertos con 0,01 mg/ml de poli-D-lisina. Cuando se alcanzó el 100% de confluencia, el medio MEM se sustituyó por medio completo Neurobasal. Después de 2 días, se añadió el medio acondicionado glial a las neuronas del hipocampo.

Las neuronas primarias del hipocampo se sometieron a electroporación en suspensión inmediatamente después de la disociación, utilizando el kit básico Nucleofector para neuronas primarias en el programa O-05 (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania). Las neuronas se sometieron a electroporación con las construcciones de interés (800 ng de cofilina humana pmRFP-N1 wt, 400 ng de cofilina humana pmRFP-N1 S3A, 400 ng de cofilina humana pmRFP-N1 S3E/1 000 000 de neuronas) en la unidad central 4D-NucleofectorTM (Amaxa) y sembradas en cubreobjetos de vidrio o en placas de Petri de plástico, como se describe anteriormente. Se usaron neuronas electroporadas a 3 DIV.

Las neuronas DIV se lavaron con HBSS helado en hielo y se rasparon en Lysis Buffer (100 μl de SDS al 1%). Las muestras se hirvieron durante 2 min a 100 °C, se sonicaron durante 5 s y se centrifugaron durante 15 min a 12 000 rpm. Se añadió tampón de muestra 5x (TrisHCl 250 mM pH 6,8, SDS al 10 %, Glicerol 30 al 30 %, β-mercapitaletanol al 5 %, azul de bromofenol al 0,02 %) a cada muestra de proteína. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (PAGE) e inmunotransferencia.

Las neuronas del hipocampo se colocaron en placas y se trataron con wt o A30P Syn durante 2 días; las incubaciones de control se obtuvieron mediante la adición del tampón de elución cromatográfica. Las neuronas se fijaron con PFA al 4 % y se tiñeron con faloidina conjugada con FITC durante 1 hora. Las neuronas tratadas con LatA 2 μM (Molecular Probes-Life Technologies) se fijaron a los 20 min y a las 2 h después del lavado de Lat A. Las neuronas tratadas con Jaspla 12 nM (Molecular Probes-Life Technologies) se fijaron a los 20 min. Las imágenes confocales se adquirieron en un microscopio confocal Leica SP2, usando una lente de objetivo Leica 63x (NA 1.4; Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Todas las imágenes se analizaron con ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Se realizaron experimentos de lapso de tiempo de campo brillante a largo plazo (hasta 16 h) en un microscopio invertido comercial (Eclipse Ti E; Nikon Instruments Inc.) con enfoque automático basado en láser y etapa motorizada para la adquisición de imágenes secuenciales multipunto. El microscopio estaba equipado con una cámara de dispositivo acoplado por carga (CCD) (Andor DU-897D-C00), Plan Fluor 40×, objetivo 0.75 NA DIC y software de imágenes (Nis Elements AR; Nikon Instruments Inc.) Se tomaron imágenes de alrededor de 10 neuronas para cada condición y las imágenes se tomaron con un intervalo de cuadro de 2 min.

Para obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, las neuronas se mantuvieron a una temperatura estable de 35 °C en una etapa de incubadora de células hecha a la medida adaptable para microscopio invertido43. Para mantener el pH fisiológico, se mezcló un gas de 5% de CO2 balanceado con aire mediante un medidor de flujo (CO2BX, Okolab) y se pasó en el portamuestras. Además, se depositó sobre los medios de cultivo una película de aceite (polidimetilsiloxano 200 Fluid, 0,913 g/ml, Sigma Aldrich), permeable al CO2 pero no al agua. Las imágenes de las neuronas se seleccionaron mediante adquisición multipunto y se tomaron imágenes a intervalos de 1 o 2 minutos por cuadro.

La fuente de disección láser fue un láser Nd:YAG UV de subnanosegundos pulsado a 355 nm (PNV001525-040, láser UV PowerChipnano-Pulse, Teem Photonics, Meylan, Francia). El daño al axón parecía restringido a la formación de un cuello cuando la energía del pulso se redujo a 1,8 μW. Se realizó una ablación en medio del axón44.

Las cámaras de Dunn se lavaron previamente con Neurobasal y luego dos veces con medio acondicionado con glía. Se añadió medio acondicionado para llenar los pocillos interior y exterior. El cubreobjetos que contenía las neuronas se invirtió sobre la cámara de Dunn, dejando una hendidura estrecha en el borde para drenar y volver a llenar el pozo exterior. Se eliminó el exceso de medio mediante transferencia con papel de filtro y se sellaron tres lados de la cámara de Dunn con parafina:vaselina caliente (1:1). Con una punta de carga de gel, todo el líquido del pocillo exterior se eliminó a través de la ranura de llenado y se añadió al pocillo exterior 8-br-cAMP 40 μM (BioLog Life Science Institute, Bremen, Alemania) diluido en medios acondicionados. A continuación, la rendija de llenado se selló con parafina:vaselina caliente. La cámara de Dunn se ensambló rápidamente para evitar cambios en el pH de los medios. Después del montaje de la cámara de Dunn, se inició inmediatamente la formación de imágenes. Las imágenes de contraste de fase de lapso de tiempo se adquirieron cada minuto, durante 30 minutos, utilizando un objetivo de 20x. Para cada cámara de Dunn, se tomaron imágenes de ~ 15 posiciones del escenario en varios lugares alrededor del puente anular. Luego se calculó el % de neuronas que giraron hacia el gradiente.

Neuronas del hipocampo sembradas en placas de Petri con fondo de vidrio llenas con 2 ml de medio acondicionado glial sin suero, se infectaron con virus pLenti4-actina YFP en DIV 1. Las neuronas se incubaron en presencia o ausencia de 5 μM wt o A30P Syn durante 2 días . Los experimentos se realizaron con neuronas a 3 DIV. Los experimentos FRAP se realizaron en el microscopio Leica TCS SP5 utilizando un objetivo de aceite de 63 × (Leica Microsystems). Se seleccionó la región de interés (ROI) y se adquirió la señal de emisión con láser de 488 nm al 20% de intensidad, como señal de preblanqueo. Posteriormente, el ROI se fotoblanqueó con tres láseres a 458 nm, 476 nm y 488 nm, todos configurados al 100% de la intensidad. La adquisición posterior al blanqueo se llevó a cabo durante 60 fotogramas a una velocidad de 1 fotograma/0,6 s. La intensidad del ROI para cada cuadro se normalizó a la intensidad inicial promedio de los cuadros previos al blanqueamiento y al área del axón blanqueado. La recuperación de la fluorescencia se corrigió por el fotoblanqueo no deseado que se producía durante la obtención de imágenes en vivo cuantificada en una región de control en el campo de visión. La intensidad de la fluorescencia (F) en cada punto de tiempo fue generada automáticamente por Leica Analyzing Software. La intensidad media calculada en los primeros 5 fotogramas corresponde al valor preblanqueo (Fpre), la intensidad media del 8º fotograma es el valor de intensidad (F0) tras la fase de fotoblanqueo que se produce en el 6º y 7º fotograma.

Las parcelas individuales de cada experimento se ajustaron a una función modelo. La recuperación de fluorescencia de actina-YFP se ajustó mejor mediante una función exponencial única (una exponencial doble no mejora significativamente la calidad del ajuste), lo que revela la presencia de fracciones de actina móviles con diferentes cinéticas de recuperación. Se aplicó el siguiente modelo:

- A es el % de fracción móvil de actina.

- B es la constante de tiempo de recuperación de la fluorescencia.

A y B se obtuvieron del ajuste de cada curva. Se calculó la media ± SEM para el % de recuperación de fluorescencia y para la constante de tiempo de recuperación de fluorescencia, para cada condición.

El gráfico final muestra el valor de intensidad de fluorescencia normalizado de (F − F0)/Fpre en el eje Y y el tiempo (s) en el eje X. El ajuste de la curva se realizó en Matlab. El análisis estadístico se realizó en el software GraphPad.

La composición y el dibujo de las imágenes se realizaron con el uso de Adobe Photoshop (Adobe System, San Jose, CA). Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism (Graph Pad, La Jolla, CA) y se expresaron como valores medios ± error estándar (SEM). La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para comparaciones múltiples (los valores de P < 0,05 se consideraron significativos).

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Agradecemos a Brett Lauring (Universidad de Columbia, NY, NY) por los plásmidos Syn. También agradecemos a M. Pesce por el apoyo técnico con experimentos de microscopía. Este trabajo fue apoyado por Telethon Foundation GGP10109 (para EC).

Departamento de Neurociencia y Tecnologías Cerebrales, Instituto Italiano de Tecnología, Génova, 16163, Italia

Sharada Tilve, Francesco Difato y Evelina Chieregatti

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ST, FD y EC concibieron y diseñaron los experimentos; ST realizó los experimentos y analizó los datos; EC escribió el documento.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Tilve, S., Difato, F. & Chieregatti, E. La activación de Cofilin 1 previene los defectos en la elongación y guía del axón inducidos por la alfa-sinucleína extracelular. Informe científico 5, 16524 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16524

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Recibido: 17 Agosto 2015

Aceptado: 15 de octubre de 2015

Publicado: 12 noviembre 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16524

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