Control de la especiación de anammox y la estrategia de fijación de biopelículas usando N | Orgullo Co., Ltd de Nanning del pavo real

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21720 (2022) Citar este artículo

645 Accesos

1 Altmetric

Detalles de métricas

La eliminación convencional de nitrógeno en el tratamiento de aguas residuales requiere un alto aporte de oxígeno y energía. La oxidación anaeróbica de amonio (anammox), la conversión de amonio y nitrito en gas nitrógeno en un solo paso, es una alternativa más rentable y energética que se aplica ampliamente al tratamiento de aguas residuales secundarias. También sería una opción de tratamiento convencional si se entendiera mejor la diversidad de especies y la fisiología. Las bacterias Anammox se enriquecieron hasta un 80 %, 90 % y 50 % de abundancia relativa, a partir de un solo inóculo, en condiciones de enriquecimiento estándar con aumentos graduales de la concentración de nitrito y amoníaco (R1), suplementos de óxido nítrico (R2) o carbono orgánico complejo. de las aguas residuales principales (R3), respectivamente. Candidatus Brocadia caroliniensis predominó en todos los reactores, pero un cambio hacia Ca. Brocadia sinica ocurrió en concentraciones de amonio y nitrito > 270 mg NH4–NL−1 y 340 mg NO2–NL−1 respectivamente. Con NO presente, se inhibió el crecimiento heterótrofo y Ca. Jettenia coexistió con Ca. B. caroliniensis antes de disminuir a medida que el nitrito aumentaba a 160 mg NO2–NL−1. La suplementación con carbono orgánico condujo a la aparición de comunidades heterótrofas que coevolucionaron con Ca. B. caroliniensis. California. B. caroliniensis y Ca. Jettenia preferentemente formó biopelículas en las superficies, mientras que Ca. Brocadia sinica formó gránulos en suspensión. Nuestros resultados indican que múltiples especies de bacterias anammox coexisten y ocupan subnichos en los reactores anammox, y que la población dominante puede cambiar de forma reversible, por ejemplo, cambiando la carga de nitrógeno (es decir, una alta concentración de nitrito favorece a Ca. Brocadia caroliniensis). La especiación tiene implicaciones para el diseño del proceso de aguas residuales, donde la estrategia óptima de inmovilización celular (es decir, portadores frente a gránulos) depende de qué especie domine.

La oxidación anaeróbica de amonio (anammox), combinada con la nitritación parcial, se aplica ampliamente para tratar aguas residuales ricas en nitrógeno y deficientes en carbono (p. ej., tratamiento secundario) debido a los importantes ahorros de energía en relación con los procesos convencionales. También se ha propuesto como una opción de tratamiento sostenible para el tratamiento de aguas residuales municipales (es decir, tratamiento principal). Se han identificado diecinueve especies de bacterias candidatus anammox en diversos entornos, incluidas zonas marinas subóxicas, sedimentos costeros, lagos y plantas de tratamiento de aguas residuales. Estos han sido clasificados en cinco géneros de Candidatus1,2,3, y aunque las bacterias anammox pueden colonizar diversos sistemas naturales y artificiales, diferentes géneros rara vez coexisten en el mismo hábitat4. Se cree que las diferencias en las tasas de crecimiento, las afinidades de los sustratos, las sensibilidades a los compuestos inhibidores, los sustratos de crecimiento preferidos y las vías metabólicas diferenciales contribuyen a la especialización del nicho1,5,6,7,8,9,10.

Se han informado cambios de población a nivel de especie y género en reactores a escala de laboratorio anammox bajo diversas condiciones9,10,11. Durante la ampliación del primer reactor anammox comercial a gran escala, la población dominante pasó de Ca. Kunenia stuttgartiensis hasta ca. Brocadia anammoxidans, aunque no se proporcionaron las razones para ello12. Los estudios han informado que las condiciones ambientales específicas en los reactores de nitritación parcial/anammox (PN/A) pueden seleccionar especies de bacterias anammox individuales únicamente11,13. Por ejemplo, Ca. Jettenia moscovienalis2, Ca. B. caroliniensis14 y Ca. B. sinica13 se detectaron en distintos reactores de corriente lateral que trataban licor de digestor anaeróbico, mientras que Ca. Brocadia. sp. 40 fue identificada como la bacteria anammox dominante en condiciones convencionales15. Park et al.11 demostraron que la composición del alimento es más importante en la selección de bacterias anammox que la configuración del inóculo y del reactor. No obstante, no existe un consenso aparente sobre qué factores seleccionan una especie de bacteria anammox sobre otra.

Esclarecer los factores que enriquecen especies específicas de bacterias anammox con propiedades cinéticas y fisiológicas específicas mejoraría potencialmente el diseño y el rendimiento del proceso. Las bacterias Anammox existen en una variedad de condiciones, como sistemas PN/A secundarios y principales con concentraciones altas y bajas de amonio/nitrito respectivamente, y es probable que muchos factores estén involucrados en la selección de especies. Si bien el nitrito (NO2−) es tóxico para las bacterias, también puede actuar como aceptor de electrones para la oxidación de amonio y donante de electrones para la reducción de bicarbonato a biomasa. Por lo tanto, aplica una presión de selección de especies de bacterias anammox sobre la base de sus capacidades para utilizarlas y tolerarlas. Se informó una reducción del 50 % en la actividad de anammox en bacterias anammox expuestas a concentraciones de NO2- entre 100 y 400 mg NL−116,17,18. Si bien el óxido nítrico (NO), un potente oxidante producido a partir del nitrito como intermediario en la ruta bioquímica anammox19,20, es tóxico, las bacterias anammox pueden tolerarlo en concentraciones más altas que muchas bacterias21,22. Además de las posibles presiones de selección de nitrito y NO, se ha descubierto que la capacidad de consumir también sustratos orgánicos (es decir, acetato y propionato) confiere ventajas competitivas al Ca. B. fulgida y Ca. Anammoxoglobus propionicus respectivamente, sobre otras especies incluyendo desnitrificantes6,7. Queda por determinar si la selección de tales 'quimioorganotrofos facultativos' se vería favorecida en el complejo medio de carbono orgánico presente en las condiciones principales. No obstante, las bacterias anammox ocupan nichos altamente especializados que se definen por algo más que las concentraciones de amonio y nitrito.

La capacidad de mejorar la actividad de especies específicas de bacterias anammox con propiedades fisiológicas y de crecimiento favorables es particularmente ventajosa para iniciar y optimizar procesos industriales anammox. Si bien los lodos anammox de flujo secundario establecidos se usan comúnmente para sembrar o bioaumentar nuevas instalaciones a gran escala, la inoculación de instalaciones a gran escala existentes que no son anammox para poner en marcha reactores anammox es un desafío logístico11 y requiere mucho tiempo debido a la sensibilidad del proceso. a la composición del alimento, el oxígeno12 y las especies microbianas competidoras23. Se requiere una alta retención de biomasa en los reactores anammox debido a las bajas tasas de crecimiento de las bacterias anammox. Esto se puede lograr promoviendo la agregación de biomasa en reactores anammox basados en biopelículas24. La biomasa en un reactor anammox puede autoensamblarse en flóculos en suspensión, películas fijas en superficies o soportes, gránulos pequeños, gránulos grandes o alguna combinación de todas estas morfologías25. Dichos agregados pueden desempeñar roles funcionalmente diferentes dentro del reactor e incluso afectar las eficiencias de eliminación de nitrógeno26,27. Comprender qué factores impulsan la selección de especies y si las diferentes especies asumen morfologías de biopelículas particulares podría informar el diseño de procesos y las estrategias de control para lograr una eliminación de nitrógeno más estable en la amplia gama de condiciones operativas que normalmente se encuentran en los biorreactores anammox28.

Este trabajo tiene como objetivo explorar cómo la composición de la comunidad anammox, el rendimiento del proceso y la morfología del biofilm se modifican por factores que se encuentran típicamente en los sistemas industriales anammox (es decir, la corriente principal en comparación con la corriente secundaria). Se planteó la hipótesis de que diferentes composiciones de sustrato, simulando (a) aguas residuales deficientes en carbono orgánico con cargas de N para aguas residuales domésticas principales y secundarias (reactores R1) y con (b) un estrés oxidativo que se encuentra típicamente en los sistemas PN/A a través de la exposición a NO (reactor R2), o (c) aguas residuales de la corriente principal de fuerza doméstica con alta DQO:N (reactor R3), podría seleccionar una comunidad distinta, específicamente especies de bacterias anammox. Si bien algunos de estos factores se han investigado previamente de forma independiente17,29, este estudio examina estos factores en la selección de especies de bacterias anammox del mismo inóculo. Obtener más información sobre cómo se puede manipular la abundancia relativa de especies de anammox informará el diseño del proceso de eliminación de N y puede contribuir a la comprensión de la partición de nichos en hábitats microbianos/ambientales complejos.

Las bacterias Anammox se enriquecieron con éxito en todas las condiciones de enriquecimiento probadas, aunque con tiempos de inicio variables. El período de inicio fue el más corto en R2 suplementado con NO y se observó actividad anammox dentro de los 20 días de la inoculación en comparación con 39 días para R1, operado en condiciones de enriquecimiento estándar (Figs. 1A, B). En presencia de carbono orgánico complejo en R3, la actividad de anammox solo se detectó después de 50 días de operación (Fig. 1C). Tanto en R1 como en R2, las concentraciones de amonio y nitrito aumentaron a 280 mg NL-1 y 350 mg NL-1, respectivamente (Fig. 1A, B), por encima de lo cual se inhibió la actividad de anammox. Además del período de puesta en marcha más corto, se aplicó un tiempo de retención hidráulica (HRT) más corto a R2 que a R1 debido a tasas de eliminación de N más altas de 1200 mg NL-1 día-1 en comparación con 800 mg NL-1 día-1 bajo operación estable (Fig. 1A,B). A pesar de la tasa de carga más alta, las concentraciones de sólidos suspendidos fueron comparables en ambos reactores, lo que indica una actividad de eliminación de N específica más alta para R2 que para R1. Se logró una tasa de carga de N significativamente más baja de 121 ± 6 mg NL-1 día-1 en R3. La concentración de amonio del efluente final disminuyó constantemente desde el día 58 al 80, y el reactor mostró una actividad estable de eliminación de amonio por parte de la bacteria anammox a partir de ese momento. El nitrito residual en el efluente también disminuyó gradualmente del día 60 al 100 junto con una disminución en la concentración de amonio (Fig. 1C). La demanda química total de oxígeno (TCOD) y la demanda química de oxígeno soluble (sCOD) promedio en el efluente fueron de 87 ± 9 mg L−1 y 51 ± 8 mg L−1, respectivamente, con una tasa de remoción promedio de 520 mg L−1 día. −1 desde el día 300 en adelante.

Puesta en marcha y enriquecimiento de bacterias anammox a partir de lodos activados alimentados con (A) aguas residuales sintéticas con amonio y nitrito en R1, (B) aguas residuales sintéticas con amonio, nitrito y aporte continuo de óxido nítrico en R2, y (C) agua primaria efluente suplementado con nitrito en R3. MLVSS (), nitrito afluente (NO2, ) y tasas de carga de nitrógeno (NLR, ) de cada condición de enriquecimiento se muestran en el panel superior de cada gráfico; con abundancia relativa de OTU de bacterias anammox dominantes afiliadas a Ca. B. caroliniensis () y Ca. B. sinica () y OTU de bacterias no anammox correlacionadas afiliadas a Anaerolineaceae () y Fimbriimonadia () se muestran en los paneles inferiores de (A, B); California. Jettenia () también se detectó en R2 (B). California. B. caroliniensis, la única bacteria anammox dominante en R3, se muestra en (C) junto con OTU de bacterias no anammox correlacionadas afiliadas a Comamonadaceae () y Ca. Aquirestis () dominando en una etapa diferente. La abundancia relativa de bacterias anammox totales se destaca como gráfico de área () en cada gráfico. Las líneas punteadas rojas indican los puntos de tiempo en los que se raspó la biopelícula de anammox de la pared del reactor y se suspendió. La comunidad química y microbiana detallada (con OTU> 5% en cualquier punto de tiempo analizado) se puede encontrar en la Fig. S1 complementaria, Información de apoyo.

Las comunidades microbianas de tres reactores se diferenciaron por día de operación (R = 0,53, p = 0,007) y por el uso de diferentes reactores, es decir, R1 vs R2 vs R3 (R = 0,38, p = 0,001). Además, las comunidades R1 y R2 en diferentes niveles de N mostraron una disimilitud relativamente fuerte (R = 0,48 y 0,57, respectivamente, con p = 0,001 para ambas). Junto con el aumento en la actividad de anammox, se observó un cambio en las bacterias anammox funcionales en R1 y R2 junto con un aumento de la carga de N, pero no en R3 donde se mantuvo una carga de N baja. La secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA mostró que las bacterias anammox estaban por debajo del límite de detección (< 0,018 %) al comienzo de la operación del reactor para los tres reactores. En R1 y R2, las unidades taxonómicas operativas (OTU) anotadas para bacterias anammox aumentaron progresivamente hasta el 80 % (día 110) y el 90 % (día 95) de las abundancias relativas de OTU, respectivamente, a una concentración de nitrito afluente > 200 mg N L- 1 (Fig. 1A,B). Las comunidades microbianas de R1 y R2 a diferentes niveles de N mostraron una disimilitud relativamente fuerte (R = 0,48 y 0,57, respectivamente, con p = 0,001 para ambos). La comunidad microbiana en el período de alta carga de N, por otro lado, no estaba muy diferenciada (R = 0,29, p = 0,003). A pesar del aumento en la abundancia relativa de múltiples OTU afiliadas a bacterias anammox tanto en R1 como en R2, una sola OTU anotada en Ca. Brocadia, identificada como Ca. B. caroliniensis por análisis de biblioteca de clones (Fig. 2), dominada durante los primeros 120 días de operación del reactor. California. B. caroliniensis aumentó durante el enriquecimiento al 50% de abundancia relativa en R1 y R2. Sin embargo, se produjo un aumento adicional en las concentraciones de amonio y nitrito afluentes más allá de 220 mg NL-1 desde el día 100 (tasa de carga de N de 500 mg NL-1-día-1 para R1 y 750 mg NL-1-día-1 para R2). en el aumento gradual de Ca. Brocadia_2, identificado como Ca. B. sinica por análisis de biblioteca de clones (Fig. 2).

Árbol filogenético basado en secuencias de ARNr 16S de OTU principales (con el sufijo "*") y clones (con el sufijo "**") de la secuenciación de amplicones y el análisis de la biblioteca de clones, respectivamente. El número de colonias idénticas por el total de colonias recogidas se indica entre paréntesis, por ejemplo, 34/40 indicaba 34 colonias idénticas por cada 40 colonias recogidas. El árbol filogenético fue generado por ARB con base de datos SILVA. Las secuencias obtenidas de la biblioteca de clones y la secuenciación de amplicones se insertaron en el árbol utilizando la herramienta de inserción de parsimonia de ARB. Las secuencias vecinas más cercanas se seleccionaron para generar el árbol final con el método de unión de vecinos con arranque de 1000 repeticiones. La línea discontinua indica la división de la familia Ca. Brocadiaceae y género Ca. Brocadia. Se seleccionó Methanosaeta concilii como grupo externo. Solo las secuencias identificadas más cercanas fueron seleccionadas para mostrarse. La escala indica un cambio de 0,1 nucleótidos por posición de nucleótido. Las afiliaciones de secuencias y las abundancias relativas de las principales bacterias anammox fueron consistentes entre la secuenciación de amplicón y el análisis de la biblioteca de clones.

Una disminución de Ca. También se observó B. caroliniensis (Fig. 1A,B). Más allá de 180 días de operación del reactor, Ca. B. sinica aumentó a 33% y 42% en abundancia relativa en R1 y R2, respectivamente, mientras que Ca. B. caroliniensis disminuyó a menos del 10% en abundancia relativa en ambos reactores. En presencia de carbono orgánico, Ca. B. caroliniensis fue el taxón anammox más dominante durante todo el proceso de enriquecimiento en R3 operado con una tasa de carga de N baja de 120 mg NL-1 día-1 (Figs. 1C). Sin embargo, la abundancia relativa de bacterias anammox totales fue significativamente menor en R3 (~ 50 %) que en R1 y R2 (~ 80 %), lo que sugiere un entorno más competitivo para las bacterias anammox en presencia de carbono orgánico. El análisis de hibridación in situ fluorescente (FISH) (Fig. 3D-F) en R1 (día 80) y R2 (día 675) indicó además que Ca. B. sinica dominó en esos reactores mientras que Ca. B. caroliniensis permaneció como la única bacteria anammox detectada en R3 (día 683). Las sondas FISH diseñadas para especies específicas sirvieron para observar cambios graduales en la población durante el funcionamiento del reactor en respuesta a cambios en los factores de control.

Imágenes de microscopía óptica de muestras de biomasa suspendida que muestran estructura granular en R1 (A) y R2 (B) y estructura flocular en R3 (C). Análisis FISH realizado en gránulos triturados para confirmar la dominancia de Ca. B. sinica (cian) en R1 (D) y R2 (E) y la prevalencia de Ca. B. caroliniensis (magenta) en R3 (F) al final de la Fase III. Todas las demás bacterias anammox están en azul. Las imágenes de PECES que se muestran aquí son representantes de la cultura. Las barras de escala de (A), (B) y (C) indican 1 mm, mientras que (D), (E) y (F) indican 1 m.

Mientras que otras OTU afiliadas al género Ca. También se detectaron brocadia, su abundancia relativa fue inferior al 10% (Fig. S1 complementaria). La presencia de estos Ca. Es probable que las OTU de Brocadia se deban a diferentes cepas de Ca. Brocadia o errores de secuenciación ya que solo se detectaron abundancias relativas bajas. Aparte de Ca. Brocadia, OTU afiliadas a Ca. Jettenia surgió para coexistir con Ca. B. caroliniensis solo en R2 (con suministro continuo de NO), lo que sugiere que la presencia de NO puede proporcionar una ventaja competitiva para Ca. Jettenia. Sin embargo, Ca. Jettenia disminuyó con el aumento de la tasa de carga de N (es decir, después del día 102).

California. Jettenia solo se observó en R2 pero no en R1 y R3, lo que podría deberse a la presencia de NO. Sin embargo, durante el proceso de enriquecimiento no estaba claro si el efecto del NO se debía a la imposición de un estrés oxidativo oa que se usaba como sustrato para la oxidación del amonio. Esto no se pudo evaluar porque el nitrito estaba en exceso durante el enriquecimiento. Por lo tanto, para investigar si se consume NO, se agotó sistemáticamente el nitrito en R2 (Fase II) mientras se dosificaba la misma cantidad de NO (Fase I). Después de 76 días de agotamiento de nitrito, el nitrito se reintrodujo gradualmente en la Fase III (Fig. 4).

El efecto del agotamiento de nitritos (Fase II) y la reposición (Fase III) sobre los cambios en (A) la comunidad de bacterias anammox de OTU afiliadas a Ca. B. caroliniensis () y Ca. B. sínica () y Ca. Jettenia () en biomasa de crecimiento suspendida (resaltada como "gránulos en suspensión" en el eje x) y adherida (resaltada como "biopelícula en la pared" en el eje x), y la tasa de consumo de NO (NCR, ) de R2 , alimentados con aguas residuales sintéticas con amonio, nitrito y suministro continuo de óxido nítrico. El nitrito (NO2) afluente se ajustó de normal (Fase I) a agotamiento (Fase II) y reposición (Fase III). La abundancia relativa de bacterias anammox totales se destaca como gráfico de área (). Las imágenes FISH se tomaron con Ca. B. sinica en cian y Ca. B. caroliniensis en magenta durante la Fase I (B) y la Fase III (C) a partir de gránulos triturados.

La reducción de la concentración de nitrito resultó en una disminución en la abundancia relativa de Ca. B. sinica en suspensión coincidiendo con un aumento en la tasa de consumo de NO (NCR), mientras que se observó un ligero aumento tanto para Ca. B. caroliniensis y Ca. Jettenia en Fase II (Fig. 4). La presencia de Ca. B. caroliniensis, ausente en la Fase I, también se detectó mediante análisis FISH en la Fase II (Fig. 4). Las pruebas de actividad por lotes realizadas durante la Fase II también mostraron una disminución en la tasa de eliminación de amonio dependiente de nitrito de 1352 mg N g MLVSS-1 día-1 antes del agotamiento de nitrito (Fase I) a 681 mg N g MLVSS-1 día-1 después agotamiento de nitritos (Fase II). Sin embargo, la actividad general en R2 fue aún más alta que en R1, incluso con una tasa específica de eliminación de amonio dependiente de nitrito de 575 mg N g MLVSS-1 día-1 (Fig. 5). Bajo operación normal (Fase I), la oxidación de amonio dependiente de NO en ausencia de nitrito en ambos reactores fue insignificante, lo que respalda aún más la hipótesis de que el nitrito en lugar del NO es el aceptor de electrones preferido y la eliminación de amonio no puede lograrse mediante Ca. B. sinica mediante acoplamiento directo a la reducción de NO. Por el contrario, las tasas de oxidación de amonio con NO en ausencia de nitrito aumentaron más de cinco veces en R2 a 440 mg N g MLVSS-1 día-1 después del agotamiento de nitrito en la Fase II en comparación con 33 y 80 mg N g MLVSS-1 día −1 en R1 y R2, respectivamente en Fase I en funcionamiento normal (Fig. 5). Esto sugiere la selección de especies de bacterias anammox capaces de utilizar NO suministrado externamente para oxidar amonio.

Experimentos de actividad por lotes con (i) NH4 + NO2, (ii) NH4 + NO2 + NO, (iii) NH4 + NO en el reactor de control R1 y el reactor experimental R2 (a) antes de la limitación de nitrito (fase I), (b) bajo nitrito limitación (fase II) y (c) después de la reposición de nitrito (fase III).

Al comienzo de la Fase III experimental, Ca. Se encontró que B. caroliniensis se encontraba en mayor abundancia relativa que Ca. B. sinica en biopelículas que se forman en la pared del reactor (Fig. 4). California. Jettenia también mostró una recuperación, aunque con poca abundancia (observada en muestras de paredes) en ausencia de nitrito (Fig. 4). Si bien no se puede confirmar si esto fue consecuencia del agotamiento de nitritos en la Fase II, las abundancias relativas de Ca. B. caroliniensis y Ca. Jettenia en la biopelícula recolectada de la pared fue mayor que en condiciones normales de operación (Fase I en la Fig. 6). Una clara inversión de Ca. B. caroliniensis a Ca. B. sinica se observó una vez que se reintrodujo el nitrito entre los días 650 y 680 (Fig. 4). Similar a lo detectado en la Fase II, el incremento en la abundancia relativa de Ca. B. sinica coincidió con la recuperación de la actividad oxidante de amonio dependiente de nitrito de 1163 mg N g MLVSS-1 día-1 que es comparable a la de la Fase I (1352 mg N g MLVSS-1 día-1) (Fig. 4) . Además, la actividad oxidante de amonio dependiente de NO también disminuyó de 440 (Fase II) a 102 (Fase III) mg N g MLVSS-1 día-1 (Fig. 5), lo que sugiere además que el aumento del consumo de NO probablemente esté relacionado con la mayor abundancia de Ca. B. caroliniensis o Ca. Jettenia o ambos. Un período prolongado bajo la limitación de nitrito podría haber mejorado aún más la recuperación de Ca. Jettenia y Ca. B. caroliniensis para superar a Ca. B. sínica. Sin embargo, esta parte del estudio apoya un vínculo entre el nitrito y el NO, la selección de especies y su modo de crecimiento preferido.

Distribución de OTU dominantes afiliadas a Ca. B. sínica y Ca. B. caroliniensis, junto con otras bacterias anammox anotadas como Brocadiaceae y bacterias no anammox en la pared (capa externa) y en suspensión (núcleo interno) de (A) R1 el día 289 (B), R2 el día 265 (C) y R3 en el día 266 (D). La composición detallada de la comunidad microbiana se puede encontrar en la Fig. S3 complementaria, Información de apoyo.

Las bacterias anammox predominantes también mostraron una clara preferencia por el crecimiento adjunto en las diversas condiciones de enriquecimiento. La biomasa de bacterias Anammox estuvo presente principalmente como gránulos suspendidos en R1 y R2, mientras que las biopelículas adheridas a la superficie del reactor dominaron en R3 (Fig. S2 complementaria). Después de la transferencia de la biopelícula de la pared del reactor a la suspensión (como se indica con la línea de puntos en la Fig. 1A-C), se observó un mayor aumento en el MLVSS de R3 (alrededor de 1,5 g L−1 en el día 230) en comparación con los otros dos reactores (menos de 0,3 g L-1 en los días 160, 209 y 258 en R1 y 153, 216 y 253 en R2), lo que sugiere un crecimiento de biopelícula más adherido en el reactor primario alimentado por efluentes (R3, Fig. 1C). Además, tras la reintroducción de nitrito en R2 durante la Fase III experimental, Ca. B. sinica mostró una tendencia a la baja, más evidente en las muestras de biofilm recolectadas de las paredes del reactor (Fig. 4) que en suspensión (p = 0.038). La diferencia en la abundancia relativa entre las muestras de pared y suspensión indica una preferencia de Ca. B. caroliniensis para crecimiento adherido. No hubo diferencia significativa entre las poblaciones de bacterias anammox de las muestras de biomasa recolectadas de la pared y la suspensión en R1 y R2, con Ca. B. sinica como la bacteria anammox dominante. Sin embargo, la abundancia relativa de Ca predominante. B. caroliniensis fue cuatro veces mayor en la biomasa recolectada de la pared que en suspensión para R3 (Fig. 6), lo que indica además que esta especie tiene una tendencia hacia el crecimiento adherido (Fig. 6). Si bien se encontró que se formaban gránulos en R1 y R2 (Fig. 3A, B), con un tamaño de partícula promedio de 1.52 y 1527.9 ± 0.078 μm (Tabla complementaria S2) respectivamente con R = 0.35 (p = 0.006) entre los dos reactores, la morfología de los agregados en R3 fue más parecida a un flóculo (Fig. 3C), con un tamaño de partícula de 310,4 ± 0,2 μm (Tabla complementaria S2) con R = 0,67 (p = 0,001) en comparación con los otros dos reactores. Por lo tanto, parece que el Ca. B. caroliniensis enriquecido en condiciones de aguas residuales domésticas que contienen carbono orgánico, no puede soportar la maduración de los gránulos y, en cambio, forma biopelículas en las paredes, en contraste con Ca. B. sinica que se detectó principalmente en la biomasa granular.

Las diversas estrategias de enriquecimiento también dieron lugar a comunidades discretas de bacterias no anammox en los tres reactores, con una mayor abundancia de OTU de bacterias no anammox en R3 en comparación con R1 y R2 (Figs. S1G, H e I). La suplementación de la fuente de carbono aumentó la riqueza (Tabla complementaria S1) en la comunidad microbiana en R3 (Chao1: 614 ± 42), pero se enriqueció selectivamente para la comunidad de bacterias no anammox (Simpson 1-D: 0.04 ± 0.01) en lugar de bacterias anammox (Simpson 1-D: 0,75 ± 0,17). Se observó menor riqueza cuando se utilizaron nitrito y amonio como sustratos principales en R1 y R2 (Chao1: 233 ± 31 y 249 ± 32 respectivamente). La suplementación de NO condujo a una riqueza ligeramente mayor pero a una menor uniformidad en R2 que en R1. California. B. sinica se correlacionó positivamente con OTU afiliadas a Fimbriimonadia (phylum Armatimonadetes) no clasificadas y Anaerolineaceae (phylum Chloroflexi) no clasificadas en R1 (rho de Spearman > 0,8, p < 0,001). Si bien la abundancia relativa de bacterias no anammox se redujo en presencia de NO, se observó la misma correlación en R2. Sin embargo, en R3, la comunidad de bacterias no anammox fue reemplazada por OTU afiliadas a Comamonadaceae no clasificadas (phylum Proteobacteria) y Bacteroidetes no clasificadas y se observó una correlación negativa entre Bacteroidetes no clasificadas y Ca. B. caroliniensis (rho de Spearman: − 0,7, p < 0,001). En particular, los taxones afiliados a la familia Comamonadaceae estuvieron casi ausentes en R1 y R2, mientras que siguieron siendo la comunidad heterótrofa dominante en la biomasa tanto adherida a la pared del reactor como en suspensión en R3, lo que quizás sugiera que estos taxones tienen interacciones metabólicas con Ca. B. caroliniensis y juega un papel en la formación de biopelículas (Fig. S3 complementaria).

Es necesario describir los factores que impulsan la diferenciación de nicho de bacterias anammox para seleccionar poblaciones con las propiedades fisiológicas y de crecimiento deseadas. Esto puede mejorar el control del proceso y la estabilidad operativa. UTO de bacterias Anammox asociadas con Ca. Brocadia, Ca. Kuenenia, Ca. Anammoxoglobus y Ca. Jettenia OTU se han detectado en sistemas de tratamiento de aguas residuales3. Aquí se seleccionaron poblaciones de bacterias anammox a partir del mismo inóculo de lodo activado. Esto se logró proporcionando diferentes sustratos (es decir, amonio, nitrito, carbono orgánico y NO) en diferentes concentraciones y cargas relevantes para los sistemas PN/A de corriente principal y secundaria. El enriquecimiento reproducible de dos especies clave de bacterias anammox, Ca. B. caroliniensis y Ca. B. sinica, se logró a partir de una sola semilla de lodos activados de los trópicos y se describieron sus nichos ecológicos preferidos. California. B. caroliniensis predominó en todos los reactores con una carga de N < 500 mg NL-1 día-1 y concentraciones de N más bajas (concentración de amonio y nitrito afluente de menos de 200 y 250, respectivamente). Un aumento en la carga y concentración de N resultó en una sucesión hacia Ca. B. sínica. California. B. caroliniensis también fue la especie más competitiva en presencia de carbono orgánico, como lo demuestra su prevalencia en R3 en condiciones de baja carga de N.

Es posible que Ca. B. caroliniensis y Ca. B. sinica desarrolló su propio nicho debido a las diferencias en la susceptibilidad a la inhibición de nitrito, ya que se aumentó la concentración de nitrito para elevar la carga de N. Un cambio en la población de Ca. B. caroliniensis a Ca. B. sinica se observó consistentemente con una concentración de nitrito creciente más allá de 340 mg NO2–NL−1 en la alimentación (es decir, 170 mg NO2–NL−1 en el reactor). Si bien esto está dentro del rango de concentraciones inhibidoras notificadas para bacterias anammox de 40 a 400 mg de NL-116,17,18,30,31,32, dicho cambio no se ha investigado previamente a nivel de especie.

Una explicación alternativa para este cambio podría ser que Ca. B. caroliniensis y Ca. B. sinica tiene diferentes propiedades cinéticas intrínsecas. Usando células planctónicas enriquecidas, la tasa de crecimiento específico y constante de afinidad de nitrito de Ca. Se determinó que B. sinica era 0,47 mg NL-1 y 0,33 día-1 (el tiempo de duplicación correspondiente de 2,1 días)29,33, que es la tasa de crecimiento máxima más alta jamás informada para la bacteria anammox. Esto indica que Ca. B. sinica son estrategas r y crecerían a altas tasas de carga de N y concentraciones de amonio y nitrito33, como se observó en nuestro estudio. Sin embargo, una estimación similar para Ca. Falta B. caroliniensis. El análisis metagenómico reveló que Ca. B. caroliniensis tiene múltiples copias de transportadores de nitrito/formiato (focA) que brindan una ventaja competitiva a bajas concentraciones de nitrito debido a una baja constante de afinidad intrínseca de nitrito14. Esto podría ayudarlos potencialmente a eliminar el nitrito de los desnitrificadores heterótrofos, especialmente cuando la competencia por el nitrito es mayor en presencia de carbono orgánico.

A pesar de la amplia gama de condiciones ambientales aplicadas en los tres reactores de enriquecimiento, Ca. Brocadia siguió siendo el filotipo más dominante durante todo el proceso de enriquecimiento, mientras que Ca. Kuenenia y Ca. No se detectaron los Anammoxoglobus que se encuentran comúnmente en los sistemas de ingeniería. Aunque la abundancia de todas las bacterias anammox fue baja en el inóculo, las condiciones operativas, especialmente la carga de nitrógeno relativamente alta, contribuyeron al enriquecimiento de Ca. Brocadia sobre otros34.

Se proporcionó NO en R2 para ejercer estrés oxidativo y también para seleccionar potencialmente bacterias anammox que utilizan NO35. Si bien la presencia de NO no parece suprimir el crecimiento de bacterias anammox, puede haber proporcionado una ventaja competitiva a Ca. Jettenia en R2, que aumentó a una abundancia relativa máxima de 23% junto con Ca. B. caroliniensis con poca carga de N (Fig. 1). Poco se sabe sobre los impulsores ecológicos y metabólicos del nicho de Ca. Jettenia, probablemente porque generalmente son menos abundantes que otros géneros de bacterias anammox3. Se demostró que bajas concentraciones de nitrito fomentan la proliferación de Ca. Jettenia sobre Ca. B. sinica4, consistente con este estudio. Sin embargo, Ca. Jettenia fue mucho menos abundante que Ca. B. caroliniensis a bajas tasas de carga de nitrito. Sin embargo, dos especies de bacterias anammox filogenéticamente distantes, Ca. B. caroliniensis y Ca. Jettenia, se demostró que coexisten en el mismo sistema, lo que respalda los hallazgos anteriores3. Sin embargo, dado que el monitoreo de la comunidad microbiana se basa únicamente en el gen 16S rRNA, se puede inducir un sesgo al enfocarse en una sola región del gen. Se podría llevar a cabo una validación adicional utilizando un enfoque de secuenciación de cebadores múltiples para mejorar la precisión de la cuantificación 36.

La coevolución de Ca. B. caroliniensis y Ca. Jettenia también podría sugerir que Ca. B. caroliniensis podría utilizar NO. Una ruta de reducción de nitrito similar en Ca. B. caroliniensis y Ca. Se sugirió Jettenia después de que se detectara un homólogo de nirK a partir del análisis metagenómico de Ca. B. caroliniensis14,37. El aumento significativo en la oxidación de amonio dependiente de NO después de la limitación de nitrito fue concomitante con la recuperación de Ca. B. caroliniensis y Ca. Poblaciones de Jettenia. Un estudio reciente informó el descubrimiento de nirS en un Ca. Genoma de Brocadia38, sin embargo, solo se encontraron transcripciones débiles y esta observación requiere una validación adicional. Es concebible que Ca. B. caroliniensis utiliza un homólogo de nirK o una nueva nitrito reductasa que emplea la vía convencional dependiente de NO para la producción de hidracina o posee la capacidad de cambiar a una vía dependiente de NO en ausencia de nitrito. De hecho, Park et al.14 e Irisa et al.39 detectaron una vía alternativa para la producción de NO a través de la oxidación de la hidroxilamina por una proteína similar a la hidroxilamina oxidorreductasa (hao). Propusieron que esta vía alternativa podría potencialmente activarse bajo la limitación de nitrito14. También se demostró que el NO oxida el amonio a gas dinitrógeno bajo limitación de nitrito en Ca. B. fulgida21 y nirS canónico estaba ausente en su genoma40.

Por el contrario, la oxidación de amonio dependiente de NO fue insignificante a concentraciones de NO significativamente más altas, lo que corrobora aún más la afirmación de que el nitrito en lugar del NO era el aceptor de electrones preferido y que la eliminación de amonio no puede lograrse mediante Ca. B. sinica a través del acoplamiento directo a la reducción de NO (Fig. 5). Mientras Ca. B. sinica no se inhibió por completo en ausencia de nitrito, su abundancia relativa disminuyó bajo la limitación de nitrito como se discutió anteriormente. Esto apoya el estudio de Oshiki et al.41 que demuestra que Ca. B. sinica no utiliza NO ni amonio para la síntesis de hidrazina, sino que utiliza hidroxilamina y amonio. Shaw et al.42 revelaron usando experimentos de marcado con 15N que el amonio se oxidaba a dinitrógeno a través de hidroxilamina como intermediario en lugar de NO en un Ca. Cultivo de enriquecimiento de Brocadia, con un electrodo como aceptor de electrones. Se observa, sin embargo, que no es posible asignar comportamientos a las especies con absoluta confianza en ausencia de cultivos puros. Todas las bacterias anammox son no cultivables, y la única opción para atribuir comportamientos a las especies e identificar sus nichos y condiciones óptimas de crecimiento son los estudios fenomenológicos en reactores de enriquecimiento. Aquí se lograron enriquecimientos de entre el 50 y el 80%, lo cual es alto para un reactor de enriquecimiento de población43; se encuentran entre los enriquecimientos anammox más altos que se han logrado en un SBR hasta el momento44. Se puede lograr un enriquecimiento al 99,5 % mediante la centrifugación de densidad Percoll45, pero la alta biomasa requerida dificulta la resolución de la comunidad microbiana a nivel de especie. Si bien los biorreactores de membrana se han utilizado para enriquecer las poblaciones planctónicas de Ca. B. sínica, ca. Scalindua29 y Ca. K. stuttgartsiensis10, nuestro enfoque también se enriqueció para especies que prefieren crecer en biopelículas como B. caroliniensis y Ca. Jettenia.

La alta retención de bacterias anammox en los reactores es un factor crucial para un funcionamiento óptimo debido a la lenta tasa de crecimiento de estas bacterias. Esto se puede lograr mediante la unión de biopelículas a los portadores, la formación de agregados de biomasa granular y otras técnicas de separación, como la filtración por membrana, para evitar el lavado de bacterias anammox. La elección de la retención de biomasa en los sistemas anammox puede estar guiada por el modo de crecimiento de las especies predominantes de bacterias anammox y la comunidad microbiana coexistente en condiciones operativas específicas. En este estudio, se demostró que la comunidad de bacterias anammox y sus estados de agregación pueden ser distintos en condiciones principales y secundarias. California. B. caroliniensis, que probablemente persiste en las condiciones principales, mostró una preferencia por el crecimiento de biopelículas adheridas. También se observó una alta diversidad y abundancia de especies heterótrofas en R3 en presencia de carbono orgánico complejo. En particular, Comamonadaceae se mantuvo como uno de los heterótrofos más abundantes en el sistema tanto en suspensión como en biopelícula. Las comanadáceas se encuentran comúnmente en comunidades formadoras de biopelículas46,47, lo que sugiere su papel potencial en ayudar a la formación de biopelículas. Crecimiento adjunto de Ca. B. caroliniensis también se observó en un proceso a gran escala que trataba líquido de digestor anaeróbico suministrado con glicerol como fuente externa de carbono14. En este caso, los portadores se pueden utilizar para proporcionar una gran superficie para lograr una alta retención de biomasa48. Los transportadores que soportan el crecimiento de biopelículas adheridas se pueden aplicar en varias configuraciones, por ejemplo, en contactores biológicos giratorios49, reactores de biopelículas de lecho móvil50,51 y reactores de biopelículas por lotes de secuenciación52. Sin embargo, Ca. B. sinica dominaba las biopelículas anammox que formaban gránulos (como se observó en R1 y R2 operados en condiciones de corriente lateral), y se pueden separar físicamente usando un hidrociclón como con los sistemas DEMON SBR53, separadores de láminas54 o configuraciones integradas de lodo activado de película fija (IFAS) con un colono55. Se encontró que una proteína extracelular particular era muy abundante en la matriz extracelular del Ca. Gránulos de B. sinica que promueven la formación de biopelículas en varias escalas de longitud debido a su capacidad para separar fases (gotas y geles) y promover la adhesión56. Esto podría explicar la mayor tendencia de Ca. B. sinica a autoagregarse (es decir, en ausencia de un sustrato, a diferencia de Ca. B caroliensis y Ca. Jettenia). A pesar de la ausencia de carbono orgánico suministrado externamente, los heterótrofos pertenecientes a la clase Fimbriimonadia (phylum Armatimonadetes) y la familia Anaerolineaceae (phylum Chloroflexi) proliferaron en R1 y R2 con una abundancia relativa de 10 a 15%. Gao et al.57 sugirieron un papel importante de Anaerolineaceae como núcleos o portadores para la formación de gránulos en el lodo de anammox y su aumento en abundancia con el tiempo sugeriría que pueden haber apoyado la granulación tanto en R1 como en R2. Sin embargo, el papel de las bacterias heterótrofas y su interacción con las bacterias anammox no se puede descubrir completamente en este estudio y requerirá más investigación.

Múltiples especies de bacterias anammox pueden enriquecerse a partir del mismo lodo activado. California. B. caroliniensis domina con bajas cargas de N, tanto en presencia como en ausencia de carbono orgánico y bajo limitación de nitrito, y forma biopelículas adheridas; California. B. sinica lo supera con cargas más altas de N y forma gránulos; y la suplementación con NO promueve Ca Jettenia a pesar de que aún desaparece en concentraciones altas de nitrato. Así, Ca. Es probable que B. caroliensis domine en los principales procesos anammox de aguas residuales, donde los portadores serían la mejor estrategia de retención de biopelículas, Ca B. sinica en tratamientos secundarios con gránulos la mejor estrategia de retención, y es poco probable que Ca Jettenia sea competitiva en los sistemas de tratamiento de aguas residuales. En conjunto, este estudio proporciona información sobre la comprensión de la relación de la selección de especies, la morfología del crecimiento y las condiciones del proceso en las aplicaciones principales y secundarias con implicaciones importantes en el diseño, el control y la gestión del proceso anammox a nivel de especie en los sistemas de tratamiento de aguas residuales a gran escala.

Aquí se usaron tres reactores por lotes de secuenciación de perspex (SBR), cada uno con un volumen de trabajo de 4 L (diámetro interno de 140 mm, altura de 260 mm) y se agitaron con un impulsor montado en la parte superior (radio de 30 mm) a 200 rpm. Fueron sembrados con lodo activado de una planta de recuperación de agua (WRP) a gran escala que realiza la eliminación biológica de nutrientes y trata las aguas usadas domésticas e industriales en Singapur. R1 y R2 se alimentaron con medio sintético desprovisto de carbono orgánico, mientras que R3 recibió efluente primario recolectado del WRP una vez por semana que comprende una fuente de carbono orgánico complejo. El medio sintético se preparó como (g L-1): KHCO3 1,25, KH2PO4 0,025, CaCl2·6H2O 0,3, MgSO4·7H2O 0,2 y FeSO4·7H2O 0,025 con aumento gradual de amonio (de 30 a 280 mg NL-1) y concentración de nitrito (39–350 mg NL−1) y 1,25 mL L−1 de solución de oligoelementos según lo descrito por van de Graaf et al.58. Argón/CO2 (95/5 %) se roció continuamente a 25 ml min-1 durante toda la fase anóxica para evitar la entrada de oxígeno en R1, mientras que R2 se roció con argón/CO2 y NO con una tasa de rociado combinada de 25 ml min- 1 a una concentración final de fase gaseosa de NO de 400 ppmv para imponer estrés oxidativo. La concentración seleccionada de 400 ppmv fue más baja que el umbral de tolerancia informado anteriormente de 600 ppmv para la bacteria anammox22. R1 y R2 se operaron en ciclos de 12 h, cada ciclo comprendía 5 min de alimentación, 108 min de ciclo anóxico, 67 min de sedimentación y decantación. Las concentraciones iniciales de amonio y nitrito se mantuvieron en 20 mg NL-1 dentro del reactor durante las primeras siete semanas, lo que resultó en un tiempo de retención hidráulica (TRH) de 24 h (se alimentaron dos litros de agua residual sintética al reactor en cada ciclo). Una vez lograda la eliminación del 100 % de amonio, las concentraciones de NH4+ y NO2− en la alimentación se incrementaron en pasos de 20 mg NL−1. NO2−: NH4+ afluente se mantuvo en una relación molar de 1,3 cercana a la estequiometría teórica59. La TRH se disminuyó gradualmente de 24 a 16 h para R1 y de 24 a 12 h para R2, de acuerdo con la capacidad de remoción de N. Por lo tanto, R2 se operó a una tasa de carga de N más alta en comparación con R1 debido al tiempo de ciclo más corto concomitante con tasas de eliminación de N más altas en R2. El pH no se controló ni en R1 ni en R2 y varió entre 7,2 y 7,8.

R3 se operó en ciclos de 8 a 12 h, cada ciclo constaba de 2 h de alimentación, 5 a 9 h de fase anóxica (dependiendo de la duración del ciclo aplicado) y 1 h de sedimentación y decantación. Antes de la sedimentación, el reactor se roció con argón/CO2 durante 5 min para eliminar el gas nitrógeno producido durante la fase anóxica para mejorar la capacidad de sedimentación del lodo. En cada período de alimentación, se agregaron 2 L de efluente primario suplementado con nitrito, lo que resultó en una TRH de 16 a 24 h. El nitrito se ajustó de acuerdo con la concentración de amonio en una relación molar de 2:1 y se almacenó en un enfriador a 4 °C para minimizar la degradación. La composición de nutrientes del efluente primario se midió después de la adición de nitrito con los valores promedio que se muestran en la Tabla complementaria S1. Se aplicó una alimentación lenta de 2 h para minimizar la introducción de oxígeno y el choque de temperatura del efluente primario almacenado en el enfriador. El pH del reactor no se controló y varió entre 7,6 y 8,5 debido a la actividad de desnitrificación. Con fines de enriquecimiento, la SRT no se controló en los tres reactores, por lo que la pérdida de lodos solo se produjo a través del muestreo para análisis de nutrientes y sólidos (SRT estimada en > 20 días).

Se conectó una camisa calefactora para mantener el SBR a 35 ± 0,05 °C para R1 y R2 y 33 ± 1 °C para R3. La concentración de oxígeno disuelto (OD) y el pH se monitorearon continuamente usando el sensor de OD Mettler Toledo InPro6050 y el sensor de pH Mettler Toledo-InPro 3250i, respectivamente. Las muestras se recogieron periódicamente al final del ciclo y se filtraron inmediatamente con filtros de 0,2 µm para análisis de nutrientes. Las muestras de licor mixto se recogieron en medio de la fase anóxica para la extracción de ADN. Para determinar la composición microbiana de la biopelícula en la superficie del reactor, se recolectaron muestras de biomasa de la pared de tres ubicaciones aleatorias después de drenar el reactor el día 289 para R1, el día 265 para R2 y el 266 para R3. Tanto las muestras suspendidas como las de biopelícula recolectadas se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción. La biopelícula en la superficie del reactor se limpió periódicamente para determinar la concentración de sólidos suspendidos en el licor mixto total (MLSS) y la fracción volátil (MLVSS) y la proporción de biomasa que estaba en suspensión frente al crecimiento adherido. También se recolectaron muestras de biomasa suspendida para el análisis del tamaño de las partículas y se obtuvieron imágenes de microscopía óptica después de lograr un enriquecimiento estable.

Para validar aún más el efecto del NO como presión de selección para la selección de especies de bacterias anammox, R2 se sometió a una reducción y reposición gradual de nitrito mientras se mantenía la disponibilidad de NO como aceptor de electrones en tres fases experimentales después de lograr un funcionamiento estable: Fase I: funcionamiento normal antes del agotamiento de nitrito, la concentración de amonio y nitrito en la alimentación era de 280 y 350 mg NL-1, respectivamente, con suministro continuo de NO a 400 ppmv en la fase gaseosa (antes del día 563); Operación limitada de nitrito de fase II (día 564-640) mediante la cual el nitrito se redujo gradualmente de 50 a 0 mg NO2-NL-1 mientras que el amonio y el NO se mantuvieron en 50 mg NH4-NL-1 y 400 ppmv, respectivamente; El nitrito de la fase III (día 640–687) se reintrodujo gradualmente de 0 a 70 mg NO2–NL−1 con las concentraciones de amonio y NO antes mencionadas en la fase II. Las muestras de biomasa suspendida se recolectaron dos veces por semana del licor mixto durante todo el experimento; sin embargo, la biopelícula adherida a la pared solo se recolectó de la Fase III debido a la cantidad limitada de biomasa de la pared. En cada fase experimental, se realizaron pruebas de actividad por lotes por triplicado con 80 mg NH4+–NL−1, 100 mg NO2–NL−1 y/o 400 ppmv NO en fase gaseosa en las siguientes condiciones con (i) amonio y nitrito solamente, (ii) amonio, nitrito y NO, y (iii) presencia de amonio y NO únicamente. La actividad anammox de R1 en funcionamiento normal con amonio y nitrito suministrados como sustrato sirvió como control. En todas las pruebas de actividad por lotes, se recogieron muestras de licor mixto cada 30 minutos y se filtraron a través de filtros Milipore de 0,22 µm para el análisis de nutrientes.

Todas las muestras recolectadas para el análisis de nutrientes se midieron para amonio, nitrito y nitrato. El amonio se midió con kits Hach®, el nitrato y el nitrito se analizaron mediante cromatografía iónica (Prominence, Shimadzu). MLSS y MLVSS se analizaron de acuerdo con los métodos estándar60. El NO se midió en la fase gaseosa usando un analizador de quimioluminiscencia en línea (Modelo: 42i, Thermoscientific). El análisis del tamaño de las partículas se llevó a cabo usando un analizador de tamaño de partículas por difracción láser (Modelo: SALD-MS30, Shimadzu), el análisis ANOSIM se llevó a cabo en las mediciones del tamaño de las partículas en muestras recolectadas de diferentes reactores.

La biomasa suspendida se recogió de cada reactor y se sometió a análisis de tamaño. Se dispersó 1 ml de biomasa en la superficie de la placa de Petri y se tomaron imágenes con un microscopio epifluorescente invertido AxioObserver Z1 (Leica, Alemania) con función de ladrillo/sello. A continuación, las imágenes se analizaron con la función Analizar partículas de imagen J61.

El ADN genómico se extrajo de muestras de biomasa utilizando el kit FastDNA™ SPIN para suelo (MP Biomedicals, EE. UU.) con optimización según Albertsen et al. (2015). La secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA de extremo emparejado fue realizada por DNAsense (http://dnasense.com/) en la Universidad de Aalborg (Dinamarca) con el conjunto de cebadores 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) y 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′) (Caporaso et al. 2011) por la plataforma Illumina Miseq como se describe en Law et al. (2016). El análisis detallado de los datos se puede encontrar en la información de apoyo (SI).

Para confirmar aún más la identificación taxonómica a nivel de especie, se construyeron cuatro bibliotecas de clones de genes 16S rRNA a partir de muestras recolectadas en los días 74, 280 de R1 y 85, 270 de R2. Las secuencias obtenidas de la biblioteca de clones y la secuenciación de amplicón de ARNr 16S se usaron para generar un árbol filogenético por ARB. Los métodos para la construcción de bibliotecas de clones y árboles filogenéticos se describen en detalle en SI.

Se recogieron muestras de biomasa suspendida y se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% durante la noche. Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato 1 × (PBS, cloruro de sodio 130 mM, tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2), las muestras de biomasa se almacenaron con etanol al 100 %: 1 × PBS 1:1 a -20 °C. FISH se realizó en muestras de biomasa triturada de acuerdo con el método descrito por Daims et al.62 con las sondas enumeradas en la Tabla 1. Los portaobjetos se observaron utilizando un microscopio confocal invertido Zeiss LSM 780 (Carl Zeiss, Jena, Alemania).

Todas las secuencias de amplicón de ARNr 16S sin procesar utilizadas en este manuscrito están disponibles en NCBI bajo Bioproject PRJNA604076. Póngase en contacto con el autor correspondiente Thomas Seviour ([email protected]) para solicitar datos de este estudio.

Ali, M. et al. Caracterización fisiológica de la bacteria anaeróbica oxidante de amonio Candidatus, "Jettenia caeni". Reinar. Microbiol. 17, 2172–2189 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Nikolaev, YA et al. Candidatus "Jettenia moscovienalis" sp. nov., una nueva especie de bacteria que lleva a cabo la oxidación anaeróbica de amonio. Microbiología 84, 256–262 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Sonthiphand, P., Hall, MW y Neufeld, JD Biogeografía de bacterias anaerobias oxidantes de amoníaco (anammox). Frente. Microbiol. 5, 399 (2014).

Artículo Google Académico

Zhang, L. et al. Competencia microbiana entre bacterias anammox en biorreactores limitados en nitrito. Agua Res. 125, 249–258 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Ding, S. et al. Características ecológicas de las bacterias anaerobias oxidantes de amoníaco. aplicación Microbio. Biotecnología. 97, 1841–1849 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Kartal, B. et al. Candidatus "Anammoxoglobus propionicus" una nueva especie oxidante de propionato de bacterias anaerobias oxidantes de amonio. sist. aplicación Microbiol. 30, 39–49 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Kartal, B. et al. El candidato "Brocadia fulgida": Una bacteria oxidante de amonio anaeróbica autofluorescente. FEMS Microbiol. 63, 46–55 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Oshiki, M., Shimokawa, M., Fujii, N., Satoh, H. y Okabe, S. Características fisiológicas de la bacteria anaeróbica oxidante de amonio Candidatus "Brocadia sinica". Microbiología 157, 1706–1713 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Park, H., Sundar, S., Ma, Y. & Chandran, K. Diferenciación en la ecología microbiana y actividad de bacterias suspendidas y adheridas en un proceso de nitritación-anammox. Biotecnología. Bioing. 112, 272–279 (2015).

Artículo CAS Google Académico

van der Star, WR et al. El biorreactor de membrana: una herramienta novedosa para cultivar bacterias anammox como células libres. Biotecnología. Bioing. 101, 286–294 (2008).

Artículo Google Académico

Parque, H. et al. Impacto de los inóculos y el modo de crecimiento en la ecología microbiana molecular de las comunidades de biorreactores de oxidación anaeróbica de amoníaco (anammox). Agua Res. 44, 5005–5013 (2010).

Artículo CAS Google Académico

der Star, WRV et al. Puesta en marcha de reactores para oxidación anóxica de amonio: Experiencias del primer reactor anammox a gran escala en Rotterdam. Agua Res. 41, 4149–4163 (2007).

Artículo Google Académico

Hu, B. et al. Identificación y cuantificación de bacterias anammox en ocho reactores de eliminación de nitrógeno. Agua Res. 44, 5014–5020 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Park, H., Brotto, AC, van Loosdrecht, MC & Chandran, K. Descubrimiento y análisis metagenómico de un enriquecimiento bacteriano anammox relacionado con Candidatus "Brocadia caroliniensis" en un proceso de tratamiento de centrifugado separado de nitritación-desnitritación alimentado con glicerol a gran escala. Agua Res. 111, 265–273 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Cao, Y. et al. Nitrificación parcial convencional y anammox en un proceso de lodos activados de 200 000 m3/día en Singapur: Reducción de escala mediante el uso de un reactor de lote alimentado en laboratorio. ciencia del agua Tecnología 74, 48–56 (2016).

Artículo Google Académico

Kimura, Y., Isaka, K., Kazama, F. y Sumino, T. Efectos de la inhibición de nitritos en la oxidación anaeróbica de amonio. aplicación Microbio. Biotecnología. 86, 359–365 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Lotti , T. , der Star , WV , Kleerebezem , R. , Lubello , C. & Loosdrecht , MV El efecto de la inhibición de nitrito en el proceso anammox . Agua Res. 46, 2559–2569 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Strous, M., Kuenen, JG & Jetten, MS Fisiología clave de la oxidación anaeróbica de amonio. aplicación. Reinar. Microbio. 65, 3248–3250 (1999).

Artículo ADS CAS Google Académico

Kartal, B. et al. Mecanismo molecular de la oxidación anaerobia del amonio. Naturaleza 479, 127–130 (2011).

Artículo ADS CAS Google Académico

Strous, M. et al. Descifrando la evolución y el metabolismo de una bacteria anammox a partir de un genoma comunitario. Naturaleza 440, 790–794 (2006).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Kartal, B. et al. Efecto del óxido nítrico en bacterias anammox. aplicación Reinar. Microbio. 76, 6304–6306 (2010).

Artículo ADS CAS Google Académico

Schmidt, I. et al. Oxidación anaeróbica de amoníaco en presencia de óxidos de nitrógeno (NOx) por dos litótrofos diferentes. aplicación Reinar. Microbio. 68, 5351–5357 (2002).

Artículo ADS CAS Google Académico

Lackner, S., Terada, A. & Smets, BF La actividad heterotrófica compromete la eliminación de nitrógeno autótrofo en biopelículas aireadas por membrana: resultados de un estudio de modelado. Agua Res. 42, 1102–1112 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Strous, M., Heijnen, J., Kuenen, J. & Jetten, M. El reactor por lotes de secuenciación como una herramienta poderosa para el estudio de microorganismos oxidantes de amonio anaeróbicos de crecimiento lento. aplicación Microbio. Biotecnología. 50, 589–596 (1998).

Artículo CAS Google Académico

Hubaux, N., Wells, G. y Morgenroth, E. Impacto de la coexistencia de flóculos y biopelículas en el rendimiento de reactores de lodos granulares combinados de nitritación-anammox. Agua Res. 68, 127–139 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Vlaeminck, SE y col. El tamaño y la arquitectura de los agregados determinan el equilibrio de la actividad microbiana para la nitritación parcial de una etapa y el anammox. aplicación Reinar. Microbio. 76, 900–909 (2010).

Artículo ADS CAS Google Académico

Volcke, E., Picioreanu, C., Baets, BD y Loosdrecht, MV La distribución del tamaño de los gránulos en un reactor de lodos granulares basado en anammox afecta la conversión: implicaciones para el modelado. Biotecnología. Bioing. 109, 1629–1636 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Wang, Q. & He, J. La asociación de anammox y bacterias desnitrificantes beneficia la recuperación de anammox de la inanición y la eliminación completa de nitrógeno. ciencia Entorno Total. 815, 152696 (2022).

Artículo ADS CAS Google Académico

Oshiki, M., Awata, T., Kindaichi, T., Satoh, H. y Okabe, S. Cultivo de bacterias planctónicas anaeróbicas de oxidación de amonio (anammox) mediante biorreactor de membrana. Microbios Entorno. 28, 436–443 (2013).

Artículo Google Académico

Bettazzi, E., Caffaz, S., Vannini, C. & Lubello, C. Inhibición de nitrito y efectos intermedios en bacterias Anammox: un estudio experimental a escala de lotes. Proceso Bioquímica. 45, 573–580 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Dapena-Mora, A. et al. Evaluación de los efectos de actividad e inhibición en el proceso Anammox mediante pruebas discontinuas basadas en la producción de gas nitrógeno. Microbio enzimático. Tecnología 40, 859–865 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Fux, C., Marchesi, V., Brunner, I. y Siegrist, H. Oxidación anaeróbica de amonio de flujos de desechos ricos en amonio en reactores de lecho fijo. ciencia del agua Tecnología 49, 77–82 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Zhang, L. et al. Revisión de la tasa máxima de crecimiento específico de las bacterias anammox. Agua Res. 116, 296–303 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Costa, MCMS et al. Impacto de inóculos y condiciones de operación en la estructura de la comunidad microbiana de dos reactores anammox. Reinar. Tecnología 35, 1811–1822 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Hu, Z., Wessels, HJCT, van Alen, T., Jetten, MSM y Kartal, B. Oxidación de amonio anaeróbico dependiente del óxido nítrico. Nat. común 10, 1244 (2019).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Orschler, L., Agrawal, S. & Lackner, S. Sobre la resolución de ambigüedades en el análisis de la comunidad microbiana de los reactores anammox de nitritación parcial. ciencia Rep.-Reino Unido. 9, 6954 (2019).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Hu, Z., Speth, DR, Francoijs, K.-J., Quan, Z.-X., Jetten, M. El análisis del metagenoma de una comunidad compleja revela el modelo metabólico de la bacteria anammox Candidatus "Jettenia asiatica". Frente. Microbiol. 3 (2012).

Yang, Y. et al. Redes microbianas complejas de ciclos de nitrógeno en tres sistemas distintos de tratamiento de aguas residuales inoculados con anammox. Agua Res. 168, 115142 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Irisa, T., Hira, D., Furukawa, K. & Fujii, T. Reducción de óxido nítrico catalizada por hidroxilamina oxidorreductasa de una bacteria anammox. J. Biosci. Bioing. 118, 616–621 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Gori, F., Tringe, SG, Kartal, B., Machiori, E. & Jetten, MS La base metagenómica del metabolismo de anammox en Candidatus "Brocadia fulgida". Bioquímica Soc. Trans. 39, 1799–1804 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Oshiki, M., Ali, M., Shinyako-Hata, K., Satoh, H. y Okabe, S. Oxidación de amonio anaeróbico dependiente de hidroxilamina (anammox) por Candidatus Brocadia sinica. Reinar. Microbiol. 18, 3133–3143 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Shaw, DR et al. Oxidación anaeróbica de amonio dependiente de transferencia de electrones extracelular por bacterias anammox. Nat. común 11, 2058 (2020).

Artículo ADS CAS Google Académico

Seviour, TW, Lambert, LK, Pijuan, M. & Yuan, Z. Inducción selectiva de la síntesis de un exopolisacárido estructural clave en gránulos aeróbicos mediante el enriquecimiento para Candidatus "Competibacter phosphatis". aplicación Microbiol. Biotecnología. 92, 1297–1305 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Strous, M., Heijnen, JJ, Kuenen, JG & Jetten, MSM El reactor por lotes de secuenciación como una poderosa herramienta para el estudio de microorganismos oxidantes de amonio anaeróbicos de crecimiento lento. aplicación Microbiol. Biotecnología. 50, 589–596 (1998).

Artículo CAS Google Académico

Strous, M. et al. Litótrofo faltante identificado como nuevo planctomiceto. Naturaleza 400, 446–449 (1999).

Artículo ADS CAS Google Académico

Bereschenko, LA, Stams, AJM, Euverink, GJW & van Loosdrecht, MCM La formación de biopelículas en membranas de ósmosis inversa es iniciada y dominada por Sphingomonas spp. aplicación Reinar. Microbio. 76, 2623–2632 (2010).

Artículo ADS CAS Google Académico

Douterelo, I., Sharpe, R. & Boxall, J. Dinámica de la comunidad bacteriana durante las primeras etapas de formación de biopelículas en un sistema de distribución de agua potable clorada experimental: Implicaciones para la decoloración del agua potable. Aplicación J. Microbiol. 117, 286–301 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Lemaire, R. et al. Desamonificación convencional con el proceso ANITA™ Mox. proc. Entorno de agua. Alimentado. 2014, 2183–2197 (2014).

Artículo Google Académico

Pynaert, K., Smets, BF, Beheydt, D. y Verstraete, W. Puesta en marcha de reactores de eliminación de nitrógeno autótrofos mediante la adición secuencial de biocatalizadores. Reinar. ciencia Tecnología 38, 1228–1235 (2004).

Artículo ADS CAS Google Académico

Agrawal, S. et al. El papel del inóculo y la configuración del reactor para la composición y la dinámica de la comunidad microbiana en los principales reactores anammox de nitritación parcial. Microbiol. Abierto. 6, e00456 (2017).

Artículo Google Académico

Lackner, S. & Horn, H. Comparación del rendimiento y la estabilidad operativa de un SBR y un MBBR para el tratamiento de aguas residuales con alta carga orgánica por nitritación-anammox de una sola etapa. Reinar. Tecnología 34, 1319–1328 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Yu, Y.-C., Gao, D.-W. & Tao, Y. Anammox puesta en marcha en la secuenciación de reactores de biofilm por lotes utilizando diferentes lodos de inoculación. aplicación Microbio. Biotecnología. 97, 6057–6064 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Wett, B. et al. Sintrofia de oxidantes de amoníaco aerobios y anaerobios. ciencia del agua Tecnología 61, 1915–1922 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Lackner, S. et al. Experiencias de nitritación parcial/anammox a gran escala: una encuesta de aplicación. Agua Res. 55, 292–303 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Malovanyy, A., Trela, J. & Plaza, E. Tratamiento principal de aguas residuales en un reactor integrado de lodos activados de película fija (IFAS) mediante un proceso de nitritación parcial/anammox. Biorrecursos. Tecnología 198, 478–487 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Seviour, T., Wong, LL, Lu, Y., Mugunthan, S., Yang, QH, Segaran, U., Bessarab, I., Liebl, D., Williams, R., Law, Y., Kjelleberg, S. Las transiciones de fase por una proteína abundante en la matriz extracelular anammox median la agregación de célula a célula y la formación de biopelículas. mBío. 02052–20 (2020).

Gao, D., Liu, L., Liang, H. y Wu, W.-M. Lodos aerobios granulares: Caracterización, mecanismo de granulación y aplicación al tratamiento de aguas residuales. crítico Rev. Biotecnología. 31, 137–152 (2011).

Artículo CAS Google Académico

de Graaf , AAV , de Bruijn , P. , Robertson , LA , Jetten , MS & Kuenen , JG Crecimiento autotrófico de microorganismos anaeróbicos oxidantes de amonio en un reactor de lecho fluidizado . Microbiología 142, 2187–2196.

Artículo Google Académico

Kartal, B. et al. Cómo vivir de la oxidación anaeróbica de amonio. FEMS Microbiol. Rev. 37, 428–461 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Eaton, A., Clesceri, LS, Rice, EW, Greenberg, AE, Franson, M. APHA: Métodos estándar para el examen de agua y aguas residuales. Edición Centenario. (APHA, AWWA, WEF, 2005).

Schneider, CA, Rasband, WS & Eliceiri, KW NIH Image to ImageJ: 25 años de análisis de imágenes. Nat. Métodos. 9, 671–675 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Daims, H., Nielsen, JL, Nielsen, PH, Schleifer, KH & Wagner, M. Caracterización in situ de bacterias oxidantes de nitrito similares a nitrospira activas en plantas de tratamiento de aguas residuales. aplicación Reinar. Microbio. 67, 5273–5284 (2001).

Artículo ADS CAS Google Académico

Descargar referencias

Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur y el Ministerio de Educación bajo el Programa del Centro de Investigación de Excelencia, y por una subvención del programa de la Fundación Nacional de Investigación (NRF), número de proyecto 1301-IRIS-59. Nos gustaría agradecer la asistencia del Sr. Larry Liew y el personal de la Junta de Servicios Públicos (PUB) de Singapur por la recolección semanal de efluentes primarios y el Sr. Eganathan Kaliyamoorthy por su ayuda en la realización de análisis de sólidos.

yang lu

Dirección actual: The Australian Centre for Ecogenomics, School of Chemistry and Molecular Biosciences, University of Queensland, St Lucia, QLD, 4072, Australia

Thi Quynh Ngoc Nguyen

Dirección actual: Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación, Singapur, 138632, Singapur

Estos autores contribuyeron por igual: Yang Lu y Gayathri Natarajan.

Centro de Ingeniería de Ciencias Ambientales de Singapur, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, 637551, Singapur

Yang Lu, Gayathri Natarajan, Thi Quynh Ngoc Nguyen, Sara Swa Thi, Krithika Arumugam, Thomas Seviour, Stefan Wuertz y Yingyu Law

Centro de Tecnología del Agua (WATEC) y Departamento de Ingeniería Química y Biológica, Universidad de Aarhus, Universitetsbyen 36, 8000, Aarhus C, Dinamarca

Tomas Seviour

Centro de Ingeniería de Ciencias de la Vida Ambiental de Singapur, Universidad Nacional de Singapur, Singapur, 119077, Singapur

Rohan BH Williams

Escuela de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, 639798, Singapur

Stefan Würtz

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

TS, YYL e YL escribieron el manuscrito y diseñaron experimentos, RW, YL y KA analizaron datos de secuenciación, GN, TN y ST mantuvieron y recopilaron datos experimentales, YL y GN analizaron los datos experimentales. Todos los autores contribuyeron a la edición del documento.

Correspondencia a Thomas Seviour.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Lu, Y., Natarajan, G., Nguyen, TQN et al. Control de la especiación de anammox y la estrategia de fijación de biopelículas utilizando intermediarios de N-biotransformación y niveles de carbono orgánico. Informe científico 12, 21720 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26069-2

Descargar cita

Recibido: 19 Octubre 2022

Aceptado: 08 diciembre 2022

Publicado: 15 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26069-2

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.