Diseño racional de proteínas fluorescentes ultraestables y reversiblemente fotoconmutables para super | Orgullo Co., Ltd de Nanning del pavo real

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 18459 (2016) Citar este artículo

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Las proteínas fluorescentes fototransformables son fundamentales para varios enfoques de nanoscopia. Sin embargo, hasta el momento no existe una variante disponible que permita obtener imágenes de superresolución en compartimentos celulares que mantienen las condiciones oxidativas. Aquí, informamos el diseño racional de dos proteínas fluorescentes intercambiables reversibles capaces de plegarse y cambiarse de foto en el periplasma bacteriano, rsFolder y rsFolder2. rsFolder fue diseñado mediante la hibridación de Superfolder-GFP con rsEGFP2 y heredó las propiedades de plegado rápido del primero junto con el cambio rápido del segundo, pero a costa de un contraste de cambio reducido. La caracterización estructural de los mecanismos de conmutación de rsFolder y rsEGFP2 reveló diferentes escenarios para la isomerización cis-trans del cromóforo y permitió diseñar rsFolder2, una variante de rsFolder que presenta un contraste de conmutación mejorado y es compatible con la nanoscopia RESOLFT. Las rsFolders se pueden expresar de manera eficiente en el periplasma de E. coli, lo que abre la puerta a la investigación a nanoescala de proteínas localizadas en compartimentos celulares hasta ahora no observables.

La visualización a nanoescala de detalles intracelulares en células vivas mediante microscopía de superresolución a menudo se basa en el empleo de proteínas fluorescentes "fototransformables" (PTFP) como marcadores codificados genéticamente1. En consecuencia, la ingeniería de PTFP con propiedades bioquímicas o fotofísicas mejoradas ha fomentado el desarrollo de una gran variedad de enfoques nanoscópicos2,3. En particular, métodos como RESOLFT (Reversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions)4, SIM no lineal (Structured Illumination Microscopy)5 o pcSOFI (Photochromic Stochastic Optical Fluctuation Imaging)6 explotan proteínas fluorescentes conmutables reversibles (RSFP) que pueden alternar repetidamente entre un ('on') y un estado no fluorescente ('off'). En los llamados RSFP verdes de "conmutación negativa", la transición de encendido a apagado compite con la emisión de fluorescencia tras la iluminación con luz cian (~490 nm), mientras que la transición de apagado a encendido responde rápidamente a la iluminación con luz violeta (~ 405 nm). La subfamilia de RSFP negativas estuvo formada primero por Dronpa7 y sus variantes8,9 y se fue enriqueciendo progresivamente con otras proteínas de origen antozoario (corales y anémonas) como rsCherryRev10, rsTagRFP11, mGeos's12 y las bifotocromáticas IrisFP13 y NijiFP14. Sin embargo, el desarrollo de la nanoscopía RESOLFT en células vivas requiere RSFP que cambien de manera eficiente incluso con baja potencia de iluminación (para minimizar el fotodaño), muestren una fluorescencia residual mínima en el estado apagado (para maximizar el contraste) y sean altamente resistentes contra la fatiga de conmutación (para soportar un gran número de ciclos sucesivos de encendido y apagado). Se descubrió que las variantes diseñadas a partir de proteínas fluorescentes de origen hidrozoario (medusas) y, en particular, del conocido EGFP, podrían cumplir estos requisitos, dando lugar a rsEGFP15 y rsEGFP216. Muy recientemente, se reportaron variantes de rsEGFP obtenidas por evolución dirigida que maduran y se expresan de manera más eficiente en el citosol de células de mamíferos17. También se introdujeron RSFP de origen antozoario con propiedades mejoradas de fotoconmutación, incluido el conmutador positivo Kohinoor18 evolucionado de Padron8 y el conmutador negativo Skylan-S, evolucionado de mEos3.119.

A pesar del intenso desarrollo de los PTFP, algunas subestructuras celulares siguen estando poco exploradas a nanoescala, en particular los compartimentos donde tiene lugar el plegamiento oxidativo, como el peroxisoma, el retículo endoplásmico, el espacio intermembrana mitocondrial o el periplasma bacteriano. Estos compartimentos aún albergan una gran cantidad de macromoléculas clave, involucradas, por ejemplo, en la captación de fármacos, la producción de energía o el metabolismo oxidativo. La razón principal de esta brecha en el campo de la superresolución es que las proteínas fluorescentes generalmente no pueden plegarse correctamente y emitir luz en entornos altamente oxidativos20. Por lo tanto, se requiere el desarrollo de un PTFP capaz de plegamiento oxidativo para facilitar la formación de imágenes de superresolución de tales compartimentos en células vivas.

El periplasma de las bacterias gramnegativas, a veces denominado vestíbulo de entrada de la célula y que representa del 20 al 40 % de su volumen total21, participa en procesos importantes como la división celular, la señalización ambiental y el transporte celular22. En consecuencia, alberga una variedad de proteínas involucradas en la acción antibiótica (p. ej., proteínas de unión a penicilina) y resistencia (p. ej., betalactamasas, porinas y componentes de bombas de eflujo)23,24. Comprender los procesos moleculares que tienen lugar en el periplasma es, por lo tanto, de interés fundamental y biomédico. Cuatro tipos de proteínas se enfrentan al plegamiento oxidativo en el periplasma: proteínas secretadas, proteínas periplásmicas, proteínas de membrana interna y proteínas de membrana externa. La mayoría de las proteínas de la membrana externa, secretadas y periplásmicas se exportan de manera postraduccional, generalmente en estado desplegado a través de la vía de secreción de Sec y, más raramente, en estado plegado a través de la vía de secreción del translocón de arginina gemela (Tat)25,26. Las proteínas de la membrana interna se insertan de manera cotraduccional, luego del reconocimiento de la cadena polipeptídica naciente que emerge del ribosoma por parte de la partícula de reconocimiento de señales bacterianas (SRP) y la unión del complejo tripartito al receptor de SRP incrustado en la membrana27. Se demostró que el sistema SRP y Sec pueden actuar de manera cooperativa para garantizar la inserción correcta de proteínas de membrana que albergan importantes dominios periplásmicos hidrofílicos28. Además, algunas proteínas periplásmicas se translocan a través de la vía SRP. Aunque se pudo observar la fluorescencia periplásmica de GFP después de la translocación posterior al plegamiento a través de Tat22, se ha demostrado que el replegamiento de GFP después de la translocación a través de Sec es problemático dentro del periplasma debido a la formación indeseable de puentes disulfuro intermoleculares en el entorno oxidativo20. Aunque no fluorescentes, estos agregados de GFP mostraron una fuerte citotoxicidad29. Por el contrario, se demostró que Superfolder-GFP20,22,30,31, una variante de GFP diseñada para una cinética de plegamiento y maduración rápida, permite estudios de localización de proteínas periplásmicas después del transporte mediado por Sec, especialmente cuando se emplea la vía SRP30. Sin embargo, Superfolder-GFP no es fototransformable y, por lo tanto, no es adecuado para imágenes de súper resolución.

Aquí, informamos el diseño racional basado en la estructura de dos nuevos RSFP superplegables, rsFolder y rsFolder2. Ambos RSFP son capaces de plegarse y fotocambiar eficientemente en el periplasma bacteriano, lo que abre la puerta a la obtención de imágenes nanoscópicas en vivo de macromoléculas en compartimentos "hostiles". Específicamente, mostramos aquí que rsFolder2 es adecuado para la obtención de imágenes RESOLFT del periplasma bacteriano.

Razonamos que Superfolder-GFP y rsEGFP2, que comparten GFP como un "ancestro" común, podrían hibridarse mediante un diseño racional puro para proporcionar una variante reversiblemente conmutable capaz de plegarse eficientemente en el entorno oxidativo del periplasma de E. coli. Las mutaciones de cuatro puntos que permitieron la evolución de EGFP a rsEGFP2 (T65A, Q69L, V163S, A206K)16 se diseñaron en Superfolder-GFP, lo que produjo un nuevo PTFP que llamamos rsFolder. La mutación T65A, conocida por conferir capacidades de fotoconmutación a rsEGFP216, se dirige al propio cromóforo Superfolder-GFP. Dos de las otras tres mutaciones se dirigen a las posiciones de aminoácidos (163 y 206) que ya se modificaron en Superfolder-GFP en relación con el ancestro de GFP (consulte la alineación de secuencias en la Fig. S1 complementaria). Elegimos conservar estas mutaciones de rsEGFP2 en rsFolder ya que se encontró que una serina en la posición 163 es fundamental para mejorar el contraste de conmutación en rsEGFP216, mientras que una lisina en la posición 206, frente al solvente, confiere un fuerte carácter monomérico a las variantes de GFP32. Por lo tanto, cuando se compara con rsEGFP2, rsFolder exhibe seis mutaciones puntuales (S31R, N40Y, S100F, T106N, Y146F y M154T), de las cuales solo una ocurre cerca del cromóforo (Y146F) (Fig. S1, Fig. S2b).

Las propiedades fotofísicas de rsFolder y rsEGFP2 son muy similares (Tabla 1, Fig. 1 y Fig. S3). Como rsEGFP2, rsFolder es un fotoconmutador negativo eficiente, tanto en forma purificada (Fig. 1a) como en células vivas (Fig. S4). Las dos proteínas muestran propiedades espectrales de absorbancia y fluorescencia casi idénticas (Fig. 1b, c). El pKa del cromóforo rsFolder (pKa = 5,5) es ligeramente más bajo que el de rsEGFP2 (pKa = 5,9) (Fig. S5, Tabla 1). Ambos RSFP maduran más lentamente que Superfolder-GFP (~ 40 min), con tiempos medios respectivos de ~ 2.5 h (rsFolder) y ~ 3 h (rsEGFP2), (Fig. 1d, Tabla 1). rsFolder también es monomérico (Fig. S6, Tabla S1) y se repliega tan rápido como Superfolder-GFP (Fig. 1e). Por lo tanto, los datos fotofísicos y bioquímicos sugieren que rsFolder ha heredado tanto las propiedades de plegado rápido de Superfolder-GFP como las propiedades de cambio rápido de rsEGFP2. Además, su emisión de fluorescencia se mantiene en un amplio rango de pH (Fig. S7).

Características espectroscópicas y bioquímicas.

Superfolder-GFP (naranja), rsEGFP2 (púrpura), rsFolder (cian) y rsFolder2 (azul marino). (a) Ciclo de conmutación a baja intensidad de iluminación (488 nm: 1,9 mW/cm2, 405 nm: 2,2 mW/cm2). rsFolder se apaga más rápido que rsEGFP2 pero alcanza una fluorescencia residual más alta en el estado apagado (recuadro). rsFolder2 se comporta de manera similar a rsEGFP2 en términos de velocidad de conmutación y contraste. El cambio residual aparente se debe únicamente a su excitación de fluorescencia directa por el láser de 405 nm. ( b, c ) Espectros de excitación y emisión de rsFolder (b, cian) y rsFolder2 (c, azul marino), en comparación con los de rsEGFP2 (púrpura). ( d ) La cinética de maduración de los cromóforos muestra que los cromóforos de rsEGFP2, rsFolder y rsFolder2 (Ala-Tyr-Gly) maduran a tasas similares, mientras que los de Superfolder-GFP (Thr-Tyr-Gly) maduran más rápido. Las barras de error representan la desviación estándar sobre mediciones por triplicado. ( e ) Cinética de recuperación de fluorescencia durante el replegamiento después de la desnaturalización caotrópica por clorhidrato de guanidina. La señal de fluorescencia se controló continuamente a 25 °C. Las barras de error representan la desviación estándar sobre mediciones por triplicado. (f) Relajación térmica de los estados apagados con foto, seguida de la absorbancia máxima en estado encendido para rsEGFP2 (púrpura), rsFolder (cian) y rsFolder2 (azul marino). Consulte la Tabla 1 para conocer los valores.

rsFolder todavía muestra sus propias peculiaridades. Primero, la estabilidad térmica de su estado apagado (~ 64 horas) es 15 veces mayor que la de rsEGFP2 (Fig. 1f y Tabla 1) y, hasta donde sabemos, sin precedentes en medio de RSFP. Además, rsFolder exhibe un nivel más alto de fluorescencia residual después de apagar que rsEGFP2, lo que lleva a un contraste de cambio reducido (Fig. 1a, Fig. S4 y Tabla 1). Esta característica surge del aumento del rendimiento cuántico de apagado a encendido y se espera que el mayor coeficiente de extinción del estado apagado a 488 nm (Tabla 1, Fig. S3) comprometa las imágenes RESOLFT. Una posible explicación de estas diferencias es que los dos RSFP se conmutan mediante mecanismos diferentes. Se requieren conocimientos a nivel molecular para corroborar aún más esta hipótesis.

Con la excepción de Dreiklang33, se ha propuesto que todas las RSFP de origen hidrozoario experimenten una isomerización cis-trans de su cromóforo al apagarse, por analogía con las RSFP de origen antozoario34. Esta hipótesis fue confirmada recientemente por estudios estructurales sobre la variante rsGreen0.7 de rsEGFP17. No está claro, sin embargo, si rsEGFP2 y rsFolder photoswitch por el mismo mecanismo o no. La inspección de los espectros de absorción de rsEGFP216 y rsFolder en su estado desactivado revela una banda ancha centrada en ~400 nm. Esto sugiere fuertemente que en ambas proteínas se aplica la regla clásica, es decir, la protonación del cromóforo se acopla con la isomerización. Para arrojar luz sobre los mecanismos de conmutación de rsFolder y rsEGFP2, resolvimos sus estructuras cristalográficas en los estados de encendido y apagado (Fig. 2 y Tabla 2). El encendido y apagado se activó mediante la iluminación de cristales con un láser de 488 nm acoplado a fibra. Los modelos se refinaron a una resolución de 1,45 Å (estado activado) y 1,50 Å (estado desactivado) para rsEGFP2 ya una resolución de 1,50 Å (estado activado) y 2,35 Å (estado desactivado) para rsFolder, respectivamente. Los mapas experimentales de diferencia de Fourier proporcionan evidencia de que en ambos RSFP, el apagado resulta de la isomerización cis-trans del cromóforo (Fig. S8). Sin embargo, nuestras estructuras revelan diferencias importantes entre los mecanismos de fotoconmutación de rsEGFP2, rsFolder y Dronpa, el arquetipo RSFP de antozoos35. En Dronpa y otros RSFP negativos como mTFP0.736 o IrisFP13, se observa una reorganización estructural drástica del entorno cromóforo al cambiar. La tríada Glu144-His193-Glu211 estrechamente unida por H en la conformación cis se reemplaza por la tríada Glu144-Arg66-Glu211 en la conformación trans, con His193 o Arg66 estabilizando el cromóforo mediante el apilamiento π y las interacciones catión-π con el p -fracción hidroxibencilideno, respectivamente34. En rsEGFP2 y rsFolder, por el contrario, no se observa tal reorganización de las redes de enlaces H y los cambios estructurales están restringidos al entorno cercano del fenolato cromóforo (Fig. 2 y Fig. S8).

Estructuras cristalinas de rsEGFP2 y rsFolder en sus estados activado y desactivado.

Se muestran modelos refinados de los cromóforos y los residuos circundantes para rsEGFP2 (a) y rsFolder (b). Los estados iniciales se muestran con átomos de carbono coloreados (púrpura y cian para rsEGFP2 y rsFolder, respectivamente). Los estados desactivados se muestran con carbones grises. Los mapas de densidad de electrones de diferencia Fobs (apagado)-Fobs (encendido) contorneados en ± 4,5 σ (amarillo: negativo; azul: positivo) resaltan los átomos que exhiben un movimiento notable desde el estado fluorescente (conformación cis) al estado de fotoconmutación (conformación trans) . Los enlaces H (2,7–2,9 Å) se muestran con líneas discontinuas.

En los RSFP negativos de antozoos, también se observó que la energía libre del estado trans se reduce por la capacidad de Ser142, que mantiene un fuerte enlace de H con el resto de hidroxibencilideno en el estado cis, para encontrar otro compañero de enlace de H en el estado cis. isomerización de cromóforos35,37. Se observa una situación similar en rsEGFP2, donde His149, que desempeña el mismo papel que Ser142 en Dronpa (distancia al fenolato de cromóforo: 2,7 Å), encuentra a Tyr146 como compañero sustituto de enlace H en el estado trans del cromóforo. Este mecanismo de cambio de foto es idéntico al informado recientemente para rsGreen0.717. Es de destacar que en estos tres RSFP, el fenolato del cromóforo fuera del estado pierde todos los enlaces de H con el andamio del barril, estando solo unido por H a una molécula de agua estructural, hasta ahora ausente en la estructura del estado activo (Fig. 2a) . Sin embargo, se ve un escenario drásticamente diferente en rsFolder, donde Tyr146 se reemplaza por una fenilalanina hidrofóbica, una de las mutaciones heredadas de Superfolder-GFP. En consecuencia, el patrón de conmutación exhibido por rsFolder es único. En el estado activado, el oxígeno del fenolato del cromóforo cis está unido por hidrógeno a Thr204, una molécula de agua e His149. Tras la isomerización, se pierden las interacciones con los dos primeros socios, mientras que His149 y el oxígeno del fenolato permanecen unidos por H, lo que da como resultado una conformación trans del cromóforo que es una imagen especular de la conformación cis (Fig. 2b). Este mecanismo altamente inusual da como resultado que el cromóforo fuera de estado de rsFolder permanezca firmemente adherido al andamio del barril y probablemente explica su excepcional estabilidad térmica. El número limitado de residuos involucrados en el cambio de encendido a apagado de rsFolder y la cascada reducida de formación de enlaces H y la interrupción que lo acompaña, podría resultar en una barrera de energía más alta para la transición de apagado a encendido en rsFolder que en rsEGFP2.

Las estructuras cristalográficas de rsEGFP2 y rsFolder en sus estados activado y desactivado proporcionan una base molecular clara para la mayor estabilidad térmica observada del estado desactivado de rsFolder. El contraste de conmutación reducido de rsFolder es más difícil de explicar en términos estructurales. La simetría única observada entre los estados de encendido y apagado de rsFolder posiblemente podría desempeñar un papel. Los datos estructurales también revelan el papel central del aminoácido en la posición 146 en la diferenciación de los mecanismos de conmutación de los dos RSFP y sugieren una estrategia sencilla para evolucionar racionalmente el mecanismo de rsFolder al de rsEGFP2, es decir, reemplazar su Phe146 por una tirosina. . Por lo tanto, se produjo y caracterizó el mutante F146Y de rsFolder, denominado rsFolder2. Como era de esperar, rsFolder2 muestra un mayor contraste de conmutación (Fig. 1a, Fig. S4) y una estabilidad térmica reducida para su estado apagado en comparación con rsFolder (Fig. 1f), lo que hace que su comportamiento fotofísico sea muy similar al de rsEGFP2. Al mismo tiempo, la maduración (Fig. 1d) y la cinética de replegamiento heredada de Superfolder-GFP se conservan esencialmente en rsFolder2 (Fig. 1d, e). En conjunto, estas propiedades (cambio de contraste, fotorresistencia, maduración y plegamiento) sugieren que rsFolder2 podría ser un candidato adecuado para la obtención de imágenes a nanoescala del periplasma bacteriano mediante microscopía RESOLFT.

Habiendo establecido que rsFolder y rsFolder2 son RSFP de cambio rápido y resistentes a la fotofatiga y que se repliegan, in vitro, tan bien como Superfolder-GFP, preguntamos si podrían plegarse y fotocambiarse en el contexto celular, es decir, cuando se expresan en el citosol (vector pET15-b) o el periplasma (vector pET26-b(+), vía Sec) de células de E. coli. El brillo de las células bacterianas, aquí expresado como la relación entre la señal de fluorescencia (a 505 nm) y la densidad óptica (a 600 nm), informa sobre la cantidad total de FP plegadas presentes en las células vivas. En comparación con la expresión citosólica, todos los clones mostraron un brillo celular bacteriano más bajo en las pruebas de expresión periplásmica, observándose el efecto más dramático en las células que expresan rsEGFP2 (Fig. S9a). La figura 3 muestra que los cultivos que expresan rsEGFP2 en el periplasma mueren prematuramente, presumiblemente debido a la acumulación y depósito de proteínas desplegadas en agregados tóxicos. Por el contrario, la expresión periplásmica de rsFolder y rsFolder2 no afecta la viabilidad celular (Fig. 3a). El brillo reducido de las células que expresan rsFolder y rsFolder2 periplásmico probablemente se origina en el volumen inherentemente más pequeño del periplasma y su carga proteica general regulada. Para verificar esta hipótesis, separamos los contenidos periplásmico y citosólico de las células y evaluamos la cantidad de RSFP presente en cada compartimento mediante fluorimetría y electroforesis en gel (Fig. S9b). Los resultados apoyan la hipótesis de que la cantidad de proteína que se puede dirigir al periplasma es limitada. Por cierto, también confirman que la fluorescencia observada en su mayoría (~ 70%) se origina en RSFP periplásmicos. Es importante destacar que los experimentos de conmutación realizados en células cultivadas en medio sólido confirman que las eficiencias de conmutación de rsFolder y rsFolder2 se conservan en el contexto celular (Fig. 3b y Fig. S4). Los datos también muestran que la resistencia a la fotofatiga es similar cuando los RSFP se dirigen al periplasma.

Expresiones citoplasmáticas y periplasmáticas y fatiga de conmutación.

( a ) El crecimiento bacteriano de una sola colonia en medio de autoinducción y otras expresiones citoplásmicas y periplásmicas de rsFolder, rsFolder2 y rsEGFP2 se monitorearon en absorbancia (rojo) y fluorescencia (negro), respectivamente, durante 20 horas. Las barras de error representan desviaciones estándar sobre mediciones por triplicado. La producción de rsEGFP2 dirigida al periplasma corresponde a una detención brutal del crecimiento bacteriano que puede explicarse por la toxicidad celular inducida por la obstrucción periplásmica. ( b ) Cambio de las mediciones de fatiga de rsFolder y rsFolder2 en comparación con rsEGFP2, expresado en el citoplasma y en el periplasma de las células vivas de E. coli. Los puntos negros indican la máxima fluorescencia en estado activo de cada ciclo de conmutación. Las correspondientes curvas de decaimiento exponencial ajustadas se muestran en rojo. Las líneas discontinuas ilustran el número de ciclos que pueden alcanzar las diferentes muestras de RSFP antes de blanquearse a la mitad de su fluorescencia inicial.

Nos pusimos a determinar si rsFolder y rsFolder2 podrían usarse para la creación de imágenes. Primero, tomamos imágenes de células que expresan rsEGFP2, rsFolder o rsFolder2 en el citosol o el periplasma mediante imágenes de campo amplio (Fig. 4a). Las células que expresan los RSFP en el citosol muestran una distribución de fluorescencia homogénea, mientras que los periplasmas claramente delineados son visibles en imágenes de células que expresan rsFolder periplásmico o rsFolder2. Como era de esperar, las células que expresan rsEGFP2 periplásmico muestran una señal apenas detectable y ninguna delimitación del periplasma.

Imágenes de campo amplio y RESOLFT.

( a ) Imágenes representativas de campo amplio de bacterias E. coli fijas que expresan rsEGFP2, rsFolder y rsFolder2 en el citoplasma o en el periplasma. Todas las imágenes se obtuvieron utilizando las mismas condiciones de iluminación y se escalaron en el mismo rango dinámico. Barra de escala: 2 μm. ( b ) Imágenes RESOLFT de bacterias E. coli vivas que expresan rsFolder2 en el periplasma e imágenes confocales limitadas por difracción correspondientes. (c) Los gráficos I-IV ilustran los perfiles de línea a través del periplasma en las ubicaciones indicadas por las flechas en (b). Cada perfil es un promedio de cinco líneas adyacentes distantes por 30 nm. Barra de escala: 1 μm

Luego realizamos microscopía RESOLFT en células de E. coli que expresan rsFolder2 periplásmico. A partir de las medidas de las regiones más estrechas, obtuvimos una resolución de ~ 70 nm para el periplasma (Fig. 4b, gráfico de líneas I). Algunas bacterias mostraron estructuras heterogéneas posiblemente debido a la presencia de peptidoglicano y proteínas asociadas que ocupan el espacio periplásmico (Fig. 4b, gráficos de líneas II-III). También pudimos distinguir el periplasma de dos bacterias adyacentes separadas por una distancia tan corta como 110 nm (Fig. 4b, gráfico de líneas IV), lo que demuestra una mejora significativa de la resolución en comparación con las imágenes limitadas por difracción. Se obtuvo una resolución similar (80 nm) en los controles en los que se expresó una fusión de rsFolder2 con queratina18 en el citosol de las células HeLa para comparar su rendimiento RESOLFT (Fig. S10)15,16. Las micrografías RESOLFT muestran que el grosor del periplasma varía ampliamente entre las células (Fig. 4b). Correlacionamos esta observación con las micrografías electrónicas, que revelan que el periplasma es generalmente más grande en las células aisladas (hasta cientos de nm) que en las células de la colonia (unas pocas decenas de nm) (Fig. S11a). La naturaleza heterogénea del periplasma y la mejora en la resolución permitida por rsFolder2 se evidencian aún más mediante la visualización de lo que podrían ser eventos de gemación de la membrana externa y formación de vesículas en las imágenes RESOLFT (indicadas por flechas en la Fig. S11b,c)38. Las micrografías electrónicas de transmisión revelan las mismas características (Fig. S11b). Por lo tanto, nuestros resultados abren la puerta a la imagen de superresolución de fluorescencia en vivo de procesos periplásmicos y de membrana externa complejos hasta ahora rastreables solo por microscopía electrónica.

Los rsFolders son los dos primeros RSFP dotados de capacidades de plegado oxidativo. Hemos demostrado que ambos pueden plegarse y cambiarse de foto en el periplasma bacteriano y que rsFolder2 puede usarse para obtener imágenes de subdifracción RESOLFT. Queda por determinar si las rsFolders se pueden utilizar en otros compartimentos celulares procarióticos o eucarióticos donde tiene lugar el plegamiento oxidativo, incluido el retículo endoplásmico, las membranas tilacoides, el espacio intermembrana mitocondrial y el medio externo39. A pesar de su menor brillo, las pantallas mutantes rsFolder2 de segunda generación mejoraron el contraste de conmutación en comparación con rsFolder, lo que las convierte en una candidata adecuada para RESOLFT. Anticipamos que esta variante también podría ser útil para otras técnicas, como la activación modelada SIM40 no lineal o pcSOFI6 para la obtención de imágenes de proteínas periplásmicas en células vivas. rsFolder no está adaptado para imágenes RESOLFT, pero puede resultar útil para otros enfoques de súper resolución, como pcSOFI o métodos potenciales que aprovechan su extrema estabilidad en estado apagado. Se puede prever un mayor ajuste de las propiedades fotofísicas del andamio de rsFolders para adaptarlo mejor a otras técnicas de superresolución. Por ejemplo, se podrían desarrollar variantes de rsFolder de cambio lento y/o desplazado hacia el rojo para microscopía de localización de una sola molécula y/o imágenes multicolores. Específicamente para las imágenes RESOLFT, rsFolder2 podría evolucionar para aumentar la resolución alcanzable, ya sea racionalmente o mediante evolución dirigida. La investigación futura determinará si tales mejoras están disponibles o no.

Se utilizaron células de E. coli DH5α para la clonación y amplificación de ADN, mientras que para la expresión se utilizaron células de E. coli BL21 (DE3). A menos que se indique lo contrario, todos los cultivos bacterianos se cultivaron en medio LB complementado con 100 μg/ml de ampicilina (rsFolder citoplasmático, rsFolder2 y rsEGFP2) o 30 μg/ml de kanamicina (Superfolder-GFP citoplasmático y rsFolder periplásmico, rsFolder2 y rsEGFP2). Los productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich.

Los plásmidos Superfolder-GFP/pET-30 y rsEGFP2/pQE31 fueron proporcionados amablemente por la Dra. Cécile Morlot y el Prof. Stefan Jakobs, respectivamente. rsFolder se diseñó en base a la estructura de Superfolder-GFP, introduciendo en la secuencia las cuatro mutaciones clave de rsEGFP2 en comparación con EGFP (T65A, Q69L, A163S y V206K). La secuencia, sintetizada por Eurofins MWG Operon, se optimizó recursivamente por codones tanto para expresiones humanas como de E. coli y se insertó una secuencia Kozak para expresión potencial en células de mamífero. Los sitios de restricción más comunes se eliminaron de la secuencia de codificación resultante para facilitar otros usos de clonación. rsFolder2 se obtuvo mediante mutagénesis dirigida, usando la plantilla rsFolder y es un mutante de punto único de rsFolder (F146Y). Para las pruebas de expresión citosólica, se subclonaron rsEGFP2, rsFolder y rsFolder2 en pET-15b (entre los sitios de restricción NdeI y BamHI). Para las pruebas de expresión periplásmica, las proteínas se subclonaron en pET-26b(+) utilizando el método de ensamblaje de Gibson41. El ADN del plásmido y los fragmentos de PCR se purificaron con un kit Qiaprep spin miniprep (Qiagen) y un kit de purificación Qiaquick PCR (Qiagen), respectivamente. El plásmido que codifica la proteína de fusión queratina18-rsFolder2 se generó reemplazando la secuencia codificante de TagRFP por la de rsFolder2 (sitios de restricción: KpnI y NotI) en el vector comercial pTagRFP-queratina (Evrogen, Moscú, Rusia).

Las proteínas fluorescentes fusionadas con una etiqueta de polihistidina N-terminal se expresaron en células E. coli BL21 (DE3). Después de la lisis celular, las proteínas fluorescentes se purificaron mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA seguida de cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna HiLoad 16/600 Superdex 75 (GE Healthcare, Freiburg, Alemania). Las proteínas purificadas se concentraron por ultrafiltración y se equilibraron en soluciones tampón (HEPES 50 mM, pH 7,5). Los cristales de rsEGFP2 y rsFolder se obtuvieron mediante el método de difusión de vapor de gota colgante a 20 °C. Brevemente, la proteína (12 mg/ml para rsEGFP2 y 10 mg/ml para rsFolder) y la solución precipitante (0,1 M HEPES pH 8,1, sulfato de amonio 1,7 M para rsEGFP2 y 0,1 M Tris pH 8,5, 20 % PEG 3350 para rsFolder) se se mezcló 1:1, produciendo gotas de 2 μl que se colocaron sobre un pocillo de 1 ml que contenía la solución precipitante. Los cristales aparecieron dentro de 1 a 7 días.

Antes de la recopilación de datos, los cristales de rsEGFP2 y rsFolder en sus estados activados se crioprotegieron mediante un breve remojo en las aguas madres complementadas con un 15 % de glicerol, seguido de un enfriamiento instantáneo en nitrógeno líquido. Para generar los estados apagados, los cristales se iluminaron durante ~ 1 min con un láser de 488 nm acoplado a fibra después de la crioprotección y antes del enfriamiento rápido en nitrógeno líquido. Los conjuntos de datos de difracción de rayos X se recolectaron a 100K en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en las líneas de luz ID23-242 (rsEGFP2) e ID2943 (rsFolder), equipados con un detector PILATUS 2M y PILATUS 6M, respectivamente. Los datos se procesaron, fusionaron y escalaron usando XDS/XSCALE y los factores de amplitud se generaron usando XDSCONV44. Las estructuras fueron escalonadas por el método de reemplazo molecular utilizando como modelo de partida la estructura de rayos X de Superfolder-GFP (PDB ID: 2B3P) y el programa PHASER45. La construcción del modelo se realizó con Coot46. La minimización de energía y el refinamiento del factor B individual siguieron a cada etapa de reconstrucción manual. Los cálculos de refinamiento y mapas se realizaron utilizando REFMAC47 y PHENIX48. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se proporcionan en la Tabla 2. Las cifras se generaron utilizando PyMOL49.

Los experimentos de velocidad de sedimentación se realizaron en una ultracentrífuga analítica XL-I (Beckman Coulter, EE. UU.), con una velocidad de rotor de 42 000 rpm, a 20 °C, utilizando un rotor AnTi-50. Dependiendo de sus concentraciones, se cargaron muestras de 55, 110 o 420 μl respectivamente en piezas centrales de doble sector de Ti de 1,5, 3 o 12 mm de paso óptico equipadas con ventanas de zafiro (Nanolytics GmbH, Alemania). Los tampones disolvente y de referencia fueron HEPES 50 mM pH 7,5; NaCl 150 mM. Se monitorearon exploraciones radiales a 280, 488 o 395 nm y de óptica de interferencia. Los datos se procesaron utilizando métodos estándar implementados en el software Sedfit, v14.6e (www.analyticalultracentrifugation.com) para el análisis de datos. Los parámetros del tampón (en particular, el coeficiente de sedimentación a 20 °C, s20w) se calcularon utilizando el programa Sednterp (sednterp.unh.edu) y asumiendo una densidad (ρ) y una viscosidad (η) de 1,008 g.ml−1 y 1,05 mPa.s, respectivamente. Los perfiles de velocidad de sedimentación se analizaron tanto en términos de distribución continua c(s) de los coeficientes de sedimentación (s)50 como en el marco del modelo de especies no interactuantes, proporcionando valores experimentales para s y concentración, por un lado y la masa molar M, por el otro. El volumen específico parcial previsto y el incremento del índice de refracción (∂n/∂c) fueron 0,733 ml.g−1 y 0,189 para rsFolder y 0,735 ml.g−1 y 0,190 para rsEGFP2, lo que indica que las dos proteínas sedimentan como monómeros. Las figuras se produjeron usando Gussi v1.0.9e (biophysics.swmed.edu/MBR/software.html).

Los espectros de absorción se registraron utilizando un fotoespectrómetro Jasco V-630 UV/VIS (Easton, EE. UU.). Los espectros de excitación (λem = 540 nm) y emisión (λex = 480 nm), así como la cinética de replegamiento, maduración y expresión, se registraron utilizando un lector de microplacas Biotek Synergy H4 (Winooski, VT, EE. UU.). Los espectros de emisión se obtuvieron usando excitación a 480 nm mientras que los espectros de excitación se obtuvieron midiendo la fluorescencia a 540 nm. Los coeficientes de extinción molar se determinaron mediante el método de Ward51. Los rendimientos cuánticos de fluorescencia se calcularon en relación con la fluoresceína (ΦFL = 0,95) y se validaron de forma cruzada entre proteínas usando el método descrito por Williams et al.52 Los valores de pKa se determinaron midiendo el pico de absorbancia aniónica de los diversos FP en función del pH, usando diferentes tampones [ácido cítrico (pH 3,5), acetato de sodio (4,0–5,0), MES (5,5–6,5), HEPES (7,0–8,5), CHES (9,0–9,5)]. Las estabilidades térmicas de los RSFP apagados se midieron monitoreando la absorción en función del tiempo, cada 10 minutos durante 1 a 5 días. Las recuperaciones de fluorescencia fotoinducidas de los FP apagados se midieron a 20 °C con un espectrómetro basado en CCD (AvaSpec-ULS2048, Avantes, Eerbeek, Países Bajos) acoplado con fibras ópticas a un portacubetas. Las proteínas diluidas (50 μl) se colocaron en una cubeta de 50 μl con 3 ventanas y se colocó un difusor cuadrado (Thorlabs, ED1-S50) frente a la cubeta para garantizar excitaciones láser homogéneas a 488 nm (1,9 mW/cm2) y 405 nm (2,2 mW/cm2). La emisión de fluorescencia se midió cada 2 s (λem = 506 ± 4 nm para rsEGFP2, rsFolder y rsFolder2; λem = 512 ± 4 nm para Superfolder-GFP).

La iluminación constante a 488 nm sirvió tanto para desconectar las proteínas como para excitar su fluorescencia, mientras que se utilizó iluminación alterna a 405 nm durante 150 segundos cada 600 segundos para promover las recuperaciones intermitentes. A continuación, se analizaron las evoluciones de la señal de fluorescencia con MATLAB (The MathWorks Inc., Natick, Massachusetts, EE. UU.) en el marco del método descrito en Duan et al.53, lo que permitió un cálculo preciso de los rendimientos cuánticos de conmutación.

Todas las proteínas se diluyeron a 0,1 mg/ml en un tampón de desnaturalización (clorhidrato de guanidina 8 M, DTT 1 mM, HEPES 50 mM, pH 7,5) y se calentaron durante 10 minutos a 65 °C. Sorprendentemente, un tratamiento con urea concentrada sin calentamiento no fue suficiente para desplegar adecuadamente estas proteínas fluorescentes. A continuación, las proteínas desnaturalizadas se diluyeron 10 veces en un tampón de renaturalización (KCl 35 mM, MgCl2 2 mM, DTT 1 mM, Tris 50 mM pH 7,5, glicerol al 30%). Para cada proteína, la cinética de replegamiento se midió siguiendo la recuperación de la fluorescencia a 25 °C (λem = 485 ± 9 nm para todas las proteínas; λem = 505 ± 9 nm para rsFolder, rsFolder2 y rsEGFP2 y a λem = 510 ± 9 nm para Superfolder -GFP) cada minuto durante 20 minutos. Los puntos de datos se ajustaron a lo largo del tiempo t con la función con k, la tasa de replegamiento; tm, el tiempo medio de replegamiento; y el parámetro de retraso derivado obtenido por . Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

La cinética de maduración se midió utilizando un protocolo adaptado de Moore et al.54 Brevemente, se cultivaron 50 ml de cultivos bacterianos en medio LB en matraces de 250 ml hasta una densidad óptica de 0,6 y luego se transfirieron a tubos sellados de 50 ml. Esto permitió crear un ambiente anaeróbico que permite la expresión de proteínas pero detiene la división celular y la maduración de los cromóforos. Las proteínas se expresaron durante la noche a temperatura ambiente después de la inducción con IPTG (1 mM). A 4 °C, las células se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en 5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 mM, 1 comprimido de cóctel antiproteasa suplementado con ADNseI) y se lisaron mediante ultrasonidos. Después de la centrifugación, se añadieron 50 μL de sobrenadante a 200 μL de tampón de reoxigenación (KCl 35 mM, MgCl2 2 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,5). Las intensidades de fluorescencia se registraron a 37 °C cada 10 minutos durante ~8 horas. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

Para garantizar un inicio sincronizado de la expresión de proteínas y para garantizar que no hubiera absorbancia o fluorescencia detectable al comienzo del experimento, las bacterias se cultivaron en un medio autoinducible para estas pruebas de expresión. Brevemente, para cada clon, se utilizó una sola colonia bacteriana para inocular 5 ml de medio de crecimiento de autoinducción55 a 25 °C, luego se distribuyó en placas de 96 pocillos con 100 μl por pocillo. Las bacterias se cultivaron utilizando glucosa como fuente de carbono hasta que se alcanzó una DO de 0,6 (~8 horas), después de lo cual se inició la expresión de la proteína cambiando a lactosa como fuente de carbono y tanto la DO (600 nm) como la fluorescencia (505 nm) se monitorearon como una función del tiempo. El brillo de las células bacterianas se expresó como la relación entre el valor de fluorescencia y la DO después de 20 h de crecimiento. Los niveles de expresión citoplasmática y periplásmica se cuantificaron adicionalmente mediante fraccionamiento bacteriano, como se describió previamente56. Brevemente, los cultivos bacterianos inducidos se sedimentaron a 3000 g durante 10 min a 4 °C, se resuspendieron en 0,5 ml de tampón TSE (Tris-HCl 200 mM pH 8, sacarosa 500 mM y EDTA 1 mM) y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Se añadieron 0,5 ml de agua helada y se incubaron durante 30 min. Las células se sedimentaron y el sobrenadante se recogió como fracción periplásmica. El sedimento se resuspendió en 5 ml de reactivo de extracción de proteínas BugBuster (Novagen 70921-3) y se incubó adicionalmente durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, los lisados se centrifugaron a 16 000 g durante 45 min a 4 °C y el sobrenadante se recogió como fracción citoplasmática. Las fracciones bacterianas se cargaron en geles de acrilamida al 12% SDS-PAGE y se visualizaron utilizando azul de Coomassie. Para cuantificar las proteínas plegadas en cada compartimento, las fracciones periplásmicas y citoplásmicas se diluyeron 10 veces en HEPES (pH 7,5) y se registraron las intensidades de fluorescencia.

Las mediciones de fatiga de conmutación en colonias vivas de E.coli se realizaron mediante irradiación alterna con luz láser de 405 nm (para encender los RSFP) y 488 nm (para apagar los RSFP). La luz se enfocó con un objetivo de 20 veces (NA = 0,4) sobre una colonia, proporcionando densidades de potencia de ~0,5 kW/cm2 (488 nm) y ~0,1 kW/cm2 (405 nm). Para cada RSFP, la iluminación se mantuvo tan corta como fue necesario para alcanzar el 100 % de fotoconmutación. La fluorescencia se registró con un PMT (tubo fotomultiplicador).

Los cultivos bacterianos se cultivaron en medio TB suplementado con glicerol al 1 % hasta una DO de 0,6 y luego se indujeron con IPTG durante la noche a 20 °C. Después de la inducción, las células se sedimentaron, se fijaron (para imágenes de campo amplio) o no (para imágenes RESOLFT) con paraformaldehído al 4% y luego se lavaron dos veces con PBS. Se depositó una gota de la suspensión celular en cubreobjetos de vidrio previamente recubiertos con quitosano (para imágenes de campo amplio) o agar LB (para imágenes RESOLFT) y se montó en portaobjetos de vidrio.

Para los experimentos con células de mamíferos, se sembraron células HeLa en portaobjetos durante la noche. La transfección se realizó utilizando Turbofect (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con el manual del fabricante. Después de 1 día de incubación, las células se pegaron en portaobjetos con silicona picodent twinsil (Picodent, Wipperfürth, Alemania), evitando la muerte y posteriormente se tomaron imágenes.

Los experimentos de imágenes de campo amplio se realizaron en un microscopio invertido IX81 Olympus equipado con un objetivo de inmersión en aceite 100X de apertura numérica 1,49 y un revólver NPS antideriva (Olympus). Las muestras se iluminaron con un rayo láser de forma gaussiana de 488 nm (Spectra-Physics, Santa Clara, EE. UU.) 300 μW, 23,5 μm FWHM polarizado circularmente.

La microscopía RESOLFT se realizó utilizando un microscopio Quad P (Abberior Instruments, Goettingen, Alemania), equipado con un objetivo de inmersión en aceite 100X de 1,4 de apertura numérica. Las imágenes RESOLFT se registraron aplicando la siguiente secuencia de iluminación en cada posición de escaneo: primero, rsFolder2 se cambió al estado encendido al iluminar con luz de 405 nm (30 μs a 2,2 a 2,5 μW). En segundo lugar, se usó un haz en forma de dona de luz de 488 nm (640 a 670 μs a 14 μW) para cambiar las proteínas en la periferia del punto focal al estado desactivado. En tercer lugar, la señal fluorescente de las proteínas residuales en estado activo en el centro de la mancha se registró a 510 nm después de la excitación con una luz de 488 nm (10 a 30 μs a 5 a 7 μW). Antes y después de la desconexión con el haz en forma de rosquilla, se introdujeron breves pausas de iluminación (hasta 60 μs) en la secuencia de conmutación. El tamaño del paso de exploración se fijó en 30 nm. La información detallada sobre el parámetro de imagen se proporciona en la tabla S2.

Se utilizó microscopía electrónica de transmisión para visualizar células de E. coli BL21 DE3 cultivadas en el intersticio entre el medio sólido de agar LB y una rejilla de microscopía electrónica57,58. Brevemente, las células se cultivaron durante la noche hasta una densidad óptica de ~1 a 600 nm. Se depositaron 20 μL de células diez veces diluidas en medio LB-agar, se incubaron durante 1 h a 37 °C, antes de agregarles una rejilla de microscopía electrónica. Las placas se incubaron durante 3 horas más a 37 °C. Luego, las rejillas EM se retiraron suavemente, se lavaron 6 veces con una gota de agua estéril y luego se tomaron imágenes directamente o después de someterse a una tinción negativa con silicotungstato de sodio al 2% (p/v). Las imágenes se tomaron en condiciones de baja dosis con un microscopio electrónico CM12 y Tecnai 12 LaB6 trabajando a 120 kV y con aumentos nominales de 22.000X y 45.000X utilizando una cámara CCD Orius TM SC1000 de Gatan.

Cómo citar este artículo: El Khatib, M. et al. Diseño racional de proteínas fluorescentes ultraestables y reversiblemente fotoconmutables para imágenes de superresolución del periplasma bacteriano. ciencia Rep. 6, 18459; doi: 10.1038/srep18459 (2016).

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Este trabajo utilizó las plataformas del Grenoble Instruct Center (ISBG: UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL) con apoyo de FRISBI (ANR-10-INSB-05-02) y GRAL (ANR-10-LABX-49-01 ) dentro de la Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB). El apoyo para este trabajo proviene de la Agence Nationale de la Recherche (ANR-2011-BSV5-012-01 NOBLEACH a DB y ANR-12-BS07-0008-03 Multiclick a JPC) y de la Université Grenoble Alpes (AGIR NanOxyd a VA ). Se agradece calurosamente a Tim Grotjohann y Stefan Jakobs del Instituto Max Plank de Química Biofísica de Göttingen por la adquisición y el procesamiento de datos de las imágenes RESOLFT, así como por sus interesantes debates. Estamos en deuda con Aline Le Roy y Christine Ebel de la plataforma ISBG PAOL por realizar experimentos analíticos de ultracentrifugación y procesar los datos, respectivamente, y con Daphna Fenel por recolectar micrografías electrónicas. La instalación de microscopía electrónica cuenta con el apoyo de la Región Rhône-Alpes, la Fondation Recherche Medicale (FRM), el Fonds Européen de Développement Régional (FEDER), el CNRS, el CEA, la Universidad de Grenoble, EMBL y GIS-Infrastrutures en Biologie , Santé et Agronomie (IBISA). Agradecemos sinceramente a Martin Byrdin y Duan Chenxi por su ayuda en la medición de los ciclos de fotoconmutación en solución para las proteínas estudiadas en este trabajo. Agradecemos a Martin Weik por la revisión del manuscrito y el apoyo continuo. Agradecemos a ESRF por el tiempo de haz en los proyectos a largo plazo MX1464, MX1583 y MX1676 (IBS BAG). Apoyo financiero de CEA, CNRS y Univ. Grenoble Alpes. MEK cuenta con el apoyo de un Ph.D. beca de la Grenoble Alliance for Integrated Structural Cell Biology (GRAL) y la Comisión Francesa de Energía Atómica (CEA).

Universidad Grenoble Alpes, IBS, F-38044, Grenoble, Francia

Mariam El Khatib, Alexandre Martins, Dominique Bourgeois, Jacques-Philippe Colletier y Virgile Adam

CNRS, IBS, F-38044, Grenoble, Francia

Mariam El Khatib, Alexandre Martins, Dominique Bourgeois, Jacques-Philippe Colletier y Virgile Adam

CEA, IBS, F-38044, Grenoble, Francia

Mariam El Khatib, Alexandre Martins, Dominique Bourgeois, Jacques-Philippe Colletier y Virgile Adam

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Investigación diseñada por MEK, JPC y VA. Muestras preparadas con MEK, ADM y VA; MEK y VA realizaron experimentos bioquímicos y fotofísicos y procesaron los datos; MEK y VA realizaron experimentos de imágenes; datos cristalográficos procesados por MEK, JPC y VA; MEK y VA refinaron las estructuras; MEK, DB, JPC y VA analizaron los datos; DB y JPC escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Este trabajo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en la línea de crédito; si el material no está incluido bajo la licencia Creative Commons, los usuarios deberán obtener el permiso del titular de la licencia para reproducir el material. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Reimpresiones y permisos

El Khatib, M., Martins, A., Bourgeois, D. et al. Diseño racional de proteínas fluorescentes ultraestables y reversiblemente fotoconmutables para imágenes de superresolución del periplasma bacteriano. Informe científico 6, 18459 (2016). https://doi.org/10.1038/srep18459

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Recibido: 28 de octubre de 2015

Aceptado: 11 de noviembre de 2015

Publicado: 06 enero 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18459

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