El mimetismo primordial induce un cambio morfológico en Escherichia coli

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 24 (2022) Citar este artículo

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La morfología de las células primitivas ha sido objeto de extensas investigaciones. Se suponía comúnmente una forma esférica en los estudios prebióticos, pero carecía de evidencia experimental en células vivas. No está claro si la forma de las células vivas cambió y cómo. Aquí expusimos la bacteria en forma de bastón Escherichia coli a un régimen de utilización de recursos que imita un entorno primordial. El oleato se proporcionó como un nutriente prebiótico modelo fácil de usar, ya que las vesículas de ácidos grasos probablemente estaban presentes en la Tierra prebiótica y podrían haber sido utilizadas como fuente de energía. Se generaron seis linajes evolutivos en condiciones libres de glucosa pero ricas en vesículas de ácido oleico (OAV). Curiosamente, el aumento de la aptitud se asoció comúnmente con el cambio morfológico de bastón a esfera y las disminuciones tanto en el tamaño como en la relación área-volumen de la célula. La forma celular cambiada se conservó en OAV o glucosa, independientemente de las compensaciones en la utilización de carbono y la abundancia de proteínas. Las mutaciones altamente diferenciadas presentes en el genoma revelaron dos estrategias distintas de adaptación a las condiciones ricas en OAV, es decir, que se dirigían directamente a la pared celular o no. El cambio en la morfología celular de Escherichia coli para adaptarse a la disponibilidad de ácidos grasos apoya la suposición de la forma esférica primitiva.

Explorar la forma de las células primitivas es crucial para comprender el origen de la vida, ya que restringe globalmente las características físicas y químicas de una célula1,2. Los estudios sobre el origen de la vida generalmente se centraron en las reacciones bioquímicas con bloques de construcción moleculares en la química prebiótica y la esencialidad de la información genética en la biología sintética3,4,5,6. Las posibles rutas hacia el origen de la vida y el desarrollo posterior hacia el último ancestro común universal (LUCA) se han estudiado intensamente7,8,9. La síntesis exitosa de polinucleótidos a partir de nucleótidos individuales10 y la replicación de ADN/ARN dentro de vesículas11,12 revelaron los mecanismos por los cuales los componentes bioquímicos funcionan en las protocélulas. La construcción exitosa de genomas sintéticos13,14,15 y genomas reducidos16,17,18,19 exploró los requisitos genéticos mínimos de las células modernas. Estos estudios proporcionaron información fructífera y modelos valiosos con respecto a los componentes básicos y los requisitos genéticos, posiblemente para las células primitivas; sin embargo, la morfología primitiva ha sido poco estudiada.

La forma de la celda primitiva sigue siendo desconocida. Ciertas morfologías, es decir, formas y/o tamaños, son cruciales para la vida celular, ya que proporcionan un espacio cerrado para que los componentes básicos funcionen correctamente y para que los materiales genéticos realicen sus funciones biológicas1,20,21. Teniendo en cuenta la simplicidad de los componentes básicos responsables de la vida celular primitiva, se asumió una estructura esférica y se ha empleado en protocélulas modelo durante décadas en estudios sobre el origen de la vida. Esta es la razón por la cual los compartimentos de forma esférica, por ejemplo, vesículas y gotitas22,23,24, se usan comúnmente para imitar a las protocélulas25,26,27. Sin embargo, por qué una célula primitiva pudo haber sido esférica y si las células primitivas preferían energética o termodinámicamente las esferas, siguen siendo preguntas abiertas. Dado que se supone que una célula primitiva no tenía pared celular, podría haber tomado fácilmente una forma esférica, como el protoplasto más o menos esférico. Además, las formas de las células modernas, por ejemplo, las bacterias, se han estudiado basándose únicamente en la homología del genoma28. Como una de las demostraciones experimentales, las bacterias en forma de L mostraron morfologías irregulares debido a deficiencias en la pared celular29,30. La mayoría de las bacterias modernas tienen maquinaria de síntesis de membrana31, que debe haber surgido durante la evolución para mantener su forma, por ejemplo, la forma de varilla, en varios géneros microbianos. En consecuencia, la célula primitiva sin ninguna membrana y/o pared celular evolucionada podría haber tenido una forma esférica32, pero se necesita evidencia experimental sobre la forma de las células primitivas.

Para adquirir tal evidencia experimental, se ha realizado una evolución experimental con células vivas modernas en el laboratorio, inducidas imitando el régimen de recursos de los ambientes primordiales, como un ensayo de devolución33. En primer lugar, se agregaron vesículas de ácido oleico (OAV) como un nutriente prebiótico modelo fácil de usar para imitar los recursos disponibles en los entornos primordiales. La composición química del ambiente primordial para el crecimiento de células primitivas siguió siendo controvertida34,35. Se pensó que las primeras formas de vida celular consumían las vesículas de ácidos grasos circundantes para su crecimiento cuando se usaban pequeñas moléculas fácilmente biodegradables en la sopa prebiótica36,37. Las vesículas de ácidos grasos fueron probablemente los principales componentes presentes en la Tierra prebiótica38 y se adoptaron como modelo de membranas de protocélulas39. Como modelo representativo de vesículas de ácidos grasos, las vesículas de ácido oleico (OAV) pueden emplearse como un recurso de carbono para la vida temprana. En segundo lugar, se emplea E. coli como modelo celular, ya que es la bacteria más representativa de la forma de bastón estable40,41. El cambio morfológico de E. coli de varilla a filamento se informa como una respuesta de estrés a la inanición42, lo que sugiere que E. coli puede cambiar su forma cuando se enfrenta a una utilización de recursos desadaptativa. Además, E. coli crece mal en ácido oleico, que es letal para otras bacterias modelo, por ejemplo, Bacillus subtills43,44,45,46. Este resultado indica que la adaptación evolutiva de E. coli a los OAV (como derivados del ácido oleico) se puede lograr dentro de la escala de tiempo experimental. Finalmente, la evolución experimental de E. coli empleó OAV como única fuente de carbono, reemplazando la glucosa de uso común. En el presente estudio, investigamos si E. coli se adapta y cómo se adapta en un entorno rico en OAV. También evaluamos cómo cambia la morfología celular durante la evolución experimental bajo esta condición.

La cepa de laboratorio E. coli MDS42ΔgalK::Ptet-gfp-kan se usó como modelo celular porque el pequeño genoma libre de IS de MDS42 era beneficioso para el análisis preciso de resecuenciación del genoma, y ​​la gfp (proteína verde fluorescente) incorporada cromosómicamente era práctica como un indicador para detección de células y análisis de población. Evolucionamos seis poblaciones de E. coli en medios suplementados con glucosa u OAV durante aproximadamente 500 generaciones (Fig. 1A y Datos complementarios 1). La transferencia en serie se llevó a cabo mientras se mantenía la fase de crecimiento exponencial (Fig. 1A complementaria), y los cultivos diarios se sometieron a citometría de flujo de imágenes para evaluar cuantitativamente la concentración celular, la morfología celular y la abundancia de proteínas celulares (Fig. 1B complementaria). Los seis linajes (L31, 32, 9~12), a partir de un originador común (Ori), aumentaron gradualmente su tasa de crecimiento a lo largo de las generaciones en presencia de OAV (Fig. 1A, arriba). La aptitud comúnmente mejorada de las seis poblaciones (L#) demostró que las células de E. coli podían utilizar OAV como fuente de carbono, lo que probablemente era una adaptación al entorno primordial rico en vesículas de ácidos grasos. En comparación, la evolución experimental paralela en glucosa (G31, 32, 9~12) presentó tasas de crecimiento más altas que las observadas en los grupos OAV pero dinámicas similares a las de los grupos OAV (Fig. 1A, abajo). Curiosamente, la magnitud de la mejora de la aptitud en presencia de OAV fue equivalente a la de la glucosa (Fig. 1B, superior), ya que los cambios en las tasas de crecimiento de las poblaciones evolucionada (Evo) y original (Ori) no fueron significativos entre los Grupos OAV y glucosa (p = 0,1). Esto demostró que la evolución experimental de una bacteria moderna en el laboratorio, inducida imitando la disponibilidad de carbono de un entorno primordial, era aplicable y comparable a la evolución en un entorno regular con azúcar como fuente de carbono.

A Cambios en la tasa de crecimiento. Se seleccionó uno de tres cultivos de diluciones variadas para la siguiente transferencia en serie. La tasa de crecimiento del cultivo seleccionado se utilizó para evaluar los cambios temporales. La regresión logarítmica de los cambios temporales está representada por la curva sólida roja. B Cambios en el crecimiento y la forma celular mediados por la evolución experimental. Los paneles superior e inferior representan los cambios de pliegue en la tasa de crecimiento y la relación de aspecto, respectivamente. Los cambios de veces se calcularon como las proporciones entre las poblaciones de punto final (L# y G#) y el Ori. Los diagramas de caja indican las distribuciones de los cambios de pliegue, en los que los seis linajes se indican con círculos abiertos. La significación estadística se indica con los valores de p. C Cambios en la forma de la celda. La forma de la celda, es decir, la relación de aspecto, de las poblaciones de células transferidas se muestra con respecto a las de (A). Las medias y las desviaciones estándar se calcularon a partir de 10 000 células sometidas a citometría de flujo de imágenes y se representan con líneas negras horizontales y verticales, respectivamente. La regresión logarítmica de los cambios temporales está representada por la curva sólida roja. Se indican las etiquetas de los seis linajes evolucionados en OAV (L#) y glucosa (G#).

Se analizó si la aptitud para el crecimiento mejorada estaba asociada con cambios morfológicos. La forma de la celda se evaluó por la relación de aspecto, que representaba la relación de longitud de los ejes mayor y menor de la celda; es decir, cuanto más cerca de 1 era la relación de aspecto, más esférica era la celda. Comúnmente se observó un aumento gradual en la relación de aspecto media de la población celular (L#) en los linajes evolucionados en OAV (Fig. 1C, arriba), a diferencia de lo que ocurrió en los linajes evolucionados en glucosa (G#) (Fig. 1C, abajo). Aunque la evolución experimental elevó la relación de aspecto independientemente de la fuente de carbono (cambios de pliegue de Evo a Ori> 1), la magnitud del cambio en los OAV fue significativamente mayor (p = 0.01) que en la glucosa (Fig. 1B, abajo) . La morfología celular se confirmó aún más mediante imágenes de una sola célula (Fig. 2 y Fig. 2 complementaria). Las células que evolucionaron en glucosa (G#) mantuvieron una forma de bastón (Fig. 2B), similar a la de las células Ori (Fig. 2A). Por el contrario, los que evolucionaron en OAV eran todos más cortos y gruesos que los que evolucionaron en Ori, y algunos de ellos eran casi esféricos, independientemente de si crecieron en OAV o glucosa (Fig. 2C). Estos resultados demuestran que la E. coli en forma de bastón, que generalmente mantiene su forma mientras metaboliza la glucosa, se volvió más esférica una vez que se adaptó a los OAV.

A Imágenes unicelulares del Ori tanto en glucosa como en OAV. B Los seis linajes evolucionados en glucosa o OAV (C) se muestran en dos escalas de tamaño. Se indican barras de escala. Los paneles superior e inferior en (C) indican los linajes evolucionados en OAV recién cultivados en OAV y glucosa, respectivamente.

Solo la forma de la célula estuvo altamente coordinada con los aumentos de aptitud, aunque la fluctuación en otras características morfológicas, es decir, el área de superficie y el volumen de la célula, ocurrieron durante la evolución (Fig. 3 complementaria). Los cambios en la tasa de crecimiento estuvieron altamente correlacionados con los de la relación de aspecto y la longitud, que se observaron universalmente en todos los linajes evolucionados en OAV (Fig. 3A y Datos complementarios 2), en contraste con la débil correlación en los linajes evolucionados en glucosa (Fig. .3B y Datos Complementarios 3). El aumento de la aptitud estuvo estrechamente asociado con los cambios en la forma de las células, lo que indicó que el consumo de OAV requería que las células cambiaran de bastones a esferas. En general, el entorno de laboratorio que imita el régimen de carbono de un entorno primordial proporciona evidencia experimental de la esfericidad de las células rodeadas de vesículas de ácidos grasos, lo que respalda la especulación de células primitivas esféricas en la Tierra prebiótica.

La significación estadística de los coeficientes de correlación entre dos de seis características, que representan el crecimiento y la morfología, se muestra en el mapa de calor. El gradiente de color de amarillo a azul indica significación estadística. El azul y el morado son muy significativos. Las seis características de crecimiento, aspecto, largo, ancho, logArea y logVol. representan la tasa de crecimiento, la relación de aspecto, la longitud relativa de la celda (L), el ancho relativo de la celda (W) y los logaritmos del área (A) y el volumen calculado de la celda (V), respectivamente. Se indican los seis linajes evolucionados en OAV (A) o glucosa (B). Los datos calculados se resumen en Datos complementarios 2 y Datos complementarios 3.

La forma esférica lograda en la adaptación a los OAV parecía ser estable cuando las células crecían en presencia de OAV y glucosa (Fig. 2C), por lo que se analizó más a fondo si la esfericidad podría mantenerse en el estado estacionario. Las relaciones de aspecto de los seis Evos, evolucionados en OAV, en estado estacionario permanecieron más grandes que las de Ori, independientemente de la concentración de OAV (0.035–3.5 mM) en el medio (Fig. 4A), lo que indica cambios conservados en forma de celda. También se observaron cambios en la forma celular de estos Evos en condiciones suplementadas con glucosa. La relación de aspecto de estos Evos se mantuvo mayor que la de Ori para todas las concentraciones de glucosa (0.105–10.5 mM, ya que los OAV transportan tres veces más átomos de carbono que la glucosa) (Fig. 4B). Se conservó el cambio en la forma celular de bastones a esferas, independientemente de la fuente de carbono. Aunque la evolución experimental se realizó dentro de la fase de crecimiento exponencial, era probable que la morfología cambiada se fijara independientemente de la fase de crecimiento.

Se muestra la forma de la celda, representada por la relación de aspecto media, en presencia de OAV (A) o glucosa (B). Los Ori y Evos se indican como círculos azules e incoloros, respectivamente. Los círculos grises (graduación de gris claro a gris oscuro) indican los seis linajes. Se indican los errores estándar de las repeticiones biológicas (N > 5). Los diagramas de caja de la relación de aspecto media, la longitud media de celda, el área logarítmica media y el volumen de las poblaciones de celdas se muestran en (C–F), respectivamente. Las pruebas individuales se indican como círculos, que corresponden a los datos en la Fig. 4 complementaria. Las medianas y los promedios de las tasas de crecimiento se representan como líneas y cruces dentro del cuadro, respectivamente. La significación estadística se indica como el valor p. Se indica el significado de la variación de color.

Además, las células de E. coli evolucionadas en OAV permanecieron más cortas y pequeñas (es decir, área y volumen) que las células Ori, independientemente de la concentración de OAV (Fig. 4 complementaria, superior). Cambiar a un tamaño más pequeño en las condiciones sin glucosa fue consistente con los hallazgos de que la evolución experimental en condiciones ricas en glucosa tenía una tendencia a adaptar las células de E. coli más grandes47. Se identificaron cambios altamente significativos y conservados en la morfología celular, incluso cuando se ignoraron los linajes evolutivos y la abundancia de OAV (Fig. 4C-F, superior). Sin embargo, solo se conservaron los cambios en la forma celular una vez que las células de E. coli evolucionaron en OAV y se cultivaron con glucosa (Fig. 4C-F, abajo). La longitud de la celda y el tamaño de la celda dependían de alguna manera de la concentración de glucosa (Fig. 4 complementaria, abajo). Los cambios en la forma celular hacia la forma esférica en lugar de otras características morfológicas fueron muy cruciales para que la E. coli utilizara los OAV como única fuente de carbono. Hasta el momento, no está claro si los OAV afectaron la morfología celular a través del metabolismo mediado por la maquinaria molecular y cómo lo hicieron, ya que tanto la evolución a corto plazo de los OAV como la evolución a largo plazo de la glucosa47,48 causan cambios en el tamaño celular. Alternativamente, los cambios en la forma celular podrían atribuirse parcialmente a los cambios en la capacidad de la membrana plasmática de E. coli causados ​​por el cambio de la fuente de carbono de glucosa a OAV, porque los cambios en la síntesis de ácidos grasos debido a tal alteración nutricional podrían influir en la capacidad de la envoltura celular, lo que afecta el tamaño y la morfología celular49.

Se identificó una compensación evolutiva en la utilización del carbono, ya que las compensaciones a menudo han ocurrido en la ecoevolución50,51 y la evolución experimental52,53. La eficiencia de utilización del carbono se representó cuantitativamente por la capacidad de carga, es decir, la concentración celular máxima (Fig. 5 complementaria) por unidad de fuente de carbono. Las capacidades de carga de los Evos (evolucionados en OAV) mostraron aumentos aproximados con OAV y disminuciones con glucosa en comparación con los de Ori (Fig. 5A). Aunque las compensaciones dependían de la riqueza de la fuente de carbono y diferían ligeramente entre estos Evo, un análisis teórico adicional por medio de regresión polinomial cúbica demostró claramente que la eficiencia de utilización de carbono mejoró en gran medida para los OAV pero disminuyó o no cambió para la glucosa ( Figura complementaria 6).

Una capacidad de carga. Se muestra el tamaño de población máximo (células/ml) por unidad (mM) de fuente de carbono (OAV o glucosa). Los Ori y Evos (evolucionados en OAV) se indican como círculos azules e incoloros, respectivamente. Los círculos grises (graduación de gris claro a gris oscuro) indican los seis linajes. Se indican los errores estándar de las replicaciones biológicas (N > 5). B Abundancia de proteínas celulares. La concentración de proteína celular está representada por GFP/V en la escala logarítmica. Los Ori y Evos (evolucionados en OAV) se indican como círculos verdes e incoloros, respectivamente. La gradación de gris claro a gris oscuro indica los seis linajes. Se indican los errores estándar de las repeticiones biológicas (N > 5).

La compensación en la capacidad de carga se relacionó con la compensación en la abundancia de proteínas celulares. La abundancia de proteína celular fue reportada por una proteína de fluorescencia verde (GFP) expresada continuamente que fue codificada cromosómicamente54. La compensación en la abundancia de proteína celular ocurrió en una dirección inversa a la de la capacidad de utilización de carbono; es decir, las concentraciones de GFP de Evos se redujeron con OAV pero aumentaron con glucosa en comparación con las de Ori (Fig. 5B). Las concentraciones reducidas de GFP podrían ser causadas por el aumento de las tasas de crecimiento debido al efecto de dilución55. Por otro lado, las concentraciones de GFP podrían incrementarse debido al tamaño reducido de las células de E. coli evolucionadas en los OAV. Dado que no solo disminuyó la abundancia relativa sino también la cantidad total de GFP con la adición de OAV (Fig. 7 complementaria), fue la disminución de la biosíntesis de proteínas (es decir, transcripción y traducción) en lugar del aumento de la tasa de dilución causada por el aumento del crecimiento que causó la reducción de las concentraciones de proteínas cuando estos Evo utilizaron OAV como fuente de carbono. La ganancia de aptitud física podría atribuirse a la biosíntesis de proteínas de bajo costo para el catabolismo de carbono de bajo costo durante el consumo de OAV.

La relación de aspecto elevada probablemente fue causada por los cambios en la longitud de la celda, ya que la longitud media, es decir, el eje principal de la celda, se acortó, mientras que el ancho permaneció igual (Fig. 8 complementaria). Podrían haber sido los cambios en el tamaño de la celda atribuidos a la longitud de la celda más corta y no el efecto de difusión mediado por el ancho de la celda lo que ayudó a las células a utilizar OAV. Además de la forma de la celda (es decir, la relación de aspecto), se analizaron el área superficial (A) y el volumen (V) de las celdas. Las proporciones de área a volumen (A/V) se redujeron significativamente con la suplementación con OAV (Fig. 6A y Fig. 9 complementaria), lo que indica que los cambios en la forma de la célula de bastones a esferas redujeron el área de la célula en mayor grado que el volumen celular. Como se pensaba que las esferas presentaban una relación A/V menor que las varillas56, las predicciones teóricas sugieren que pueden impedir la difusión de pequeñas moléculas del medio ambiente57,58. Se supuso que la forma de barra con su relación A/V más alta era ventajosa para utilizar moléculas pequeñas, por ejemplo, glucosa, pero no para moléculas grandes, por ejemplo, ácidos oleicos. Alternativamente, la pequeña relación A/V no inhibió la utilización de ácidos grasos58, y la forma esférica fue neutral para el uso de OAV. Curiosamente, tanto los Ori como los Evos (evolucionados en OAV) aumentaron la relación A/V ante la sustitución de una fuente de carbono, que se suponía que estaba adaptada a glucosa y OAV, respectivamente. Cuando se cultivaron en condiciones de mala adaptación, es decir, los Ori en OAV y los Evos en glucosa, todos elevaron las relaciones A/V como estrategia de adaptación de primera elección. Las proporciones A/V de los Evos aumentaron en glucosa (Fig. 6A, negro) para ser comparables con la proporción de Ori en glucosa. Aunque se sabía que las células se hicieron más grandes con el aumento de nutrientes49,59, no estaba claro si la condición rica en glucosa era un aumento de nutrientes para los Evos, que evolucionaron en OAV. Las células de E. coli adaptadas a OAV probablemente favorezcan relaciones A/V más grandes en glucosa que en OAV para una mejor difusión de glucosa, para mejorar la utilización de glucosa. La relación A/V de Ori aumentó con la suplementación con OAV (Fig. 6A. azul), aunque no fue beneficiosa. Elevar la proporción A/V parecía ser la primera opción para la adaptación, ya que la mayoría de los linajes mostraron mayores proporciones A/V en la fase temprana de la evolución (Fig. 10 complementaria).

A Diagramas de caja de las razones de área a volumen. Se muestran los Ori (azul) y Evos (negro) cultivados en presencia de OAV (cuadros sombreados) o glucosa (cuadros abiertos). Las proporciones medias de área a volumen (A/V) de las poblaciones celulares (medidas) se indican como círculos. Las medianas y los promedios de las relaciones A/V medias se representan como líneas y cruces dentro de la caja, respectivamente. La significación estadística se indica como el valor p. B Tasa de crecimiento en glucosa. Azul y negro indican los Ori y Evos, respectivamente. Las tasas de crecimiento de mediciones repetidas se indican como círculos. Las medianas y los promedios de las tasas de crecimiento se representan como líneas y cruces dentro del recuadro, respectivamente. La significación estadística se indica como el valor p.

Además, las relaciones A / V levemente pero significativamente aumentadas no lograron mejorar la utilización de glucosa, pero aumentaron la tasa de crecimiento en glucosa independientemente de la concentración de glucosa o el linaje evolutivo (Fig. 6B y Fig. 11 complementaria). Fue muy intrigante que se produjera una compensación evolutiva en la capacidad de carga pero no en la aptitud para el crecimiento. La adaptación para usar OAV aumentó la capacidad de crecimiento tanto para OAV como para glucosa, lo que contradecía las ventajas y desventajas evolutivas en la capacidad de crecimiento60,61,62, incluso en la misma cepa de E. coli63. En conjunto, los hallazgos sugieren que la forma esférica podría ahorrar material y energía para la síntesis de la membrana, lo que es ventajoso en condiciones de escasez de recursos o cuando la célula sufre un metabolismo que cuesta energía. Si el recurso de las vesículas de ácidos grasos hubiera sido deficiente en la Tierra primitiva, las células primitivas podrían haberse beneficiado de la forma esférica al ahorrar recursos para el crecimiento. La utilización de OAV podría ser una ruta metabólica que cuesta energía para E. coli (como rutas delegadas en las células modernas debido a la evolución natural); por lo tanto, Evos debe haber privilegiado las formas esféricas para lograr un crecimiento que ahorre energía. Si los cambios morfológicos son la forma más fácil de regular el metabolismo para lograr un crecimiento eficiente en respuesta a los cambios nutricionales, es razonable que las células modernas hayan desarrollado una maquinaria molecular para el control del tamaño, lo que también afecta la forma celular como consecuencia49. Aunque se desconoce la naturaleza tanto de la célula primitiva como del entorno primordial, el presente estudio proporciona una demostración de apoyo de protocélulas esféricas que crecen en un entorno primordial rico en vesículas de ácidos grasos.

La alteración de bastones a esferas de E. coli se asoció con una amplia variedad de mutaciones sin mutaciones comunes (Fig. 7), lo que sugiere múltiples estrategias genéticas para los cambios morfológicos. Curiosamente, la mutación observada se fijó dentro del mismo gen, el regulador transcripcional global crp64,65 activado por cAMP, en tres de los seis linajes. Como se han informado mutaciones en crp en otros experimentos de evolución con glucosa66,67,68, la regulación transcripcional por crp podría ser crucial para que E. coli use fuentes de carbono de manera eficiente. Los cambios morfológicos deben haber estado asociados con alteraciones en el metabolismo del carbono para lograr un crecimiento equilibrado. Aunque crp fue un objetivo de mutación compartido entre L32, L10 y L12, las posiciones mutadas variaron (Datos complementarios 4 y 5). Como las mutaciones eran sustituciones o eliminaciones no sinónimas (Datos complementarios 4 y 5), que alteraban las funciones de los genes, deben beneficiar los cambios en la forma celular asociados con el aumento de la aptitud durante la evolución. Aproximadamente el mismo número de mutaciones ocurrieron en los seis linajes, lo que indica una presión evolutiva comparable entre ellos.

Se indican las mutaciones del genoma detectadas en los seis Evos. Los genes esenciales se indican con asteriscos. Los genes que desempeñaron un papel en la estructura celular y la abundancia de proteínas celulares se destacan en rojo y azul, respectivamente. El gen mutado que apareció en múltiples linajes está en negrita. Las formas celulares de las células de E. coli originales y evolucionadas se ilustran en la parte inferior.

Una estrategia genética común fue apuntar a los genes que participan en la transcripción y traducción (Fig. 7, azul), lo que concordaba bien con la compensación en la abundancia de proteínas celulares. El enriquecimiento en mutaciones en la biosíntesis de proteínas apoyó la hipótesis de que innumerables innovaciones en maquinaria de traducción, códigos genéticos, etc. ocurrieron durante la evolución de la vida primitiva a la moderna69. Además, se notaron diversas estrategias para cambiar la forma de la célula. Se produjeron mutaciones que alteraban la organización de la pared celular en L31, L32 y L12 pero no en L9, L10 o L11 (Fig. 7, rojo). Los genes mrdB, mrdA y mreC, que son responsables de la biosíntesis de peptidoglicano70,71, la regulación de la forma celular72,73 y la formación de formas de bastoncillos74, respectivamente, probablemente cambiaron directamente la forma celular de bastones a esferas. Era razonable que los genes relacionados con la estructura celular fueran un objetivo de alta prioridad durante la evolución porque estaban ausentes en la vida temprana y podrían excluirse del genoma mínimo13, es decir, no son esenciales para la célula primitiva. Tenga en cuenta que las estrategias directas e indirectas podrían reconocerse tanto en la dinámica evolutiva de la aptitud para el crecimiento y la forma celular como en el nivel morfológico.

El presente estudio proporciona la primera evidencia experimental de células bacterianas en forma de bastón que cambian a formas esféricas en un entorno de laboratorio que imita el régimen de recursos del entorno primordial, además de las demostraciones prebióticas de células primitivas intensamente informadas. Si la forma de bastón se atribuyó a la evolución de la pared celular y otras estructuras celulares, el cambio inverso de bastón a forma esférica podría considerarse una ruptura de las estructuras celulares bien establecidas que utilizan las células modernas. La evolución experimental de los cambios en la forma de las células que aumentan la aptitud física puede considerarse hasta cierto punto una devolución morfológica. La amplia variedad de mutaciones indica la gran variedad de estrategias genéticas para la evolución de la vida primitiva. La reconstrucción genética futura podría proporcionar una aclaración razonable de la adaptación asociada al cambio morfológico a las vesículas de ácidos grasos.

Dado que la morfología se considera un rasgo plástico, no está claro cuánto tiempo se puede mantener una forma esférica en un entorno primordial. La predicción teórica según la dinámica evolutiva (Fig. 1) mostró que la evolución extendida desencadenaría aumentos tanto en la tasa de crecimiento como en la relación de aspecto, independientemente de la fuente de carbono (Fig. 12 complementaria). Sin embargo, la relación de aspecto de las células evolucionadas en OAV presentó una gran variación entre los seis linajes, lo que indica la alta plasticidad de la forma esférica en el entorno primordial. Aunque las mutaciones del genoma fijo indicaron la estabilidad de la esfericidad, la evolución extendida en los OAV podría conducir a nuevas mutaciones que alteran las características morfológicas y cambian la forma de la célula. La presente demostración experimental con E. coli podría no representar la universalidad de las determinaciones morfológicas de las células primitivas; sin embargo, muestra cierta evolución morfológica de bastones a esferas por una bacteria moderna rodeada de vesículas de ácidos grasos. Durante décadas se especuló con una célula primitiva esférica, probablemente debido a la estabilidad física y termodinámica de las esferas. El presente estudio proporciona una comprensión razonable de los beneficios de crecimiento de las células esféricas en entornos primordiales, y sus hallazgos respaldan firmemente esta especulación, al igual que los estudios de prebióticos. Recientemente se informó sobre la protocélula de forma ovoide (LUCA) y la bacteria temprana con forma de bastón (LBCA)75. Se requieren estudios futuros que combinen células sintéticas y materiales genéticos para aclarar completamente la forma celular original.

Para la evolución experimental se utilizó una cepa de E. coli de laboratorio modificada genéticamente, MDS42ΔgalK::Ptet-gfp-kan, que se construyó previamente54. La cepa portaba el genoma reducido MDS42, que se derivó originalmente del genoma de tipo salvaje MG1655 al eliminar los transposones16.

Los medios mínimos suplementados con OAV se prepararon mezclando tres soluciones madre con ddH2O, lo que dio como resultado composiciones finales de K2H2O4 62 mM, KH2PO4 39 mM, (NH4)2SO4 15 mM, FeSO4 0,009 mM, clorhidrato de tiamina 0,015 mM, MgSO4 0,2 mM y OAV de 0,035 a 3,5 mM. Las soluciones base, de oligoelementos y OAV fueron tres soluciones madre. La solución base, que comprende K2HPO4 310 mM, KH2PO4 195 mM, (NH4)2SO4 75 mM y FeSO4 0,045 mM, se ajustó a pH 8,3 con KOH 2 M. La solución de oligoelementos comprendía clorhidrato de tiamina 15 mM y MgSO4 203 mM. La solución de OAV, que comprende vesículas de ácido oleico 5 mM, se preparó según el método de un informe anterior76 con modificaciones menores. En primer lugar, se preparó la solución micelar suspendiendo 316 μL de ácido oleico (aceite puro) previamente desgasificado en 4,19 mL de agua alcalina (pH > 10), que había sido preparada añadiendo 190 μL de NaOH 5 M a 4 mL de ddH2O. La solución suspendida (micelas de oleato 250 mM) se mezcló y agitó durante la noche a temperatura ambiente. Posteriormente, la solución de OAV se preparó diluyendo micelas de oleato 250 mM hasta una concentración final de 5 mM y ajustando a pH 8,3 con HCl (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, China). Todos los medios se extruyeron tres veces con una extrusora LE-200 (Morgec, China) y una membrana de policarbonato de nucleoporo de 0,2 μm (Whatman, Reino Unido) y luego se esterilizaron con unidades de filtración de 250 ml equipadas con membranas de 0,22 μm (Millipore, EE. UU.). Los medios mínimos suplementados con glucosa, que comprenden K2HPO4 62 mM, KH2PO4 39 mM, (NH4)2SO4 15 mM, FeSO4 0,009 mM, clorhidrato de tiamina 0,015 mM, MgSO4 0,2 mM y glucosa 0,105–10,5 mM, se prepararon como se describió anteriormente77. Finalmente, los medios se ajustaron a pH 8,3 con KOH 2 M, de manera similar a los medios suplementados con OAV. Los reactivos químicos utilizados para la preparación del medio se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.), a menos que se indique lo contrario.

La cepa de E. coli se inoculó inicialmente en 200 μL del medio mínimo con OAV 3,5 mM en una placa de 96 micropocillos de fondo plano (Corning, EE. UU.) sellada con CyclerSeal Sealing Film (Axygen, EE. UU.). Las microplacas se incubaron en un bioshaker (MBR-022UP, Taitec, Japón) con una velocidad de rotación de 200 rpm a 37 °C. Las células sometidas a pases varias veces se sometieron a aislamiento de una sola colonia sembrando el cultivo celular en placas de agar LB (Fig. 1A complementaria). Solo una de las colonias individuales fue seleccionada como Ori para la evolución experimental. La colonia seleccionada se inoculó en 3 mL del medio mínimo con OAV 3,5 mM y se cultivó hasta aproximadamente 108 células/mL. El cultivo celular resultante se conservó como reserva y se usó como el Ori común de la evolución experimental. Tenga en cuenta que una inserción de un solo nucleótido de T en ygiM, que codifica la antitoxina higA, se detectó inicialmente en Ori en comparación con la cepa de E. coli.

Se generaron seis linajes independientes que evolucionaron en OAV (L#) o glucosa (G#) a partir del stock común de los Ori descritos anteriormente. Las células se cultivaron en 3 mL de medio mínimo con OAV 3,5 mM o glucosa 10,5 mM y los cultivos celulares se incubaron en un bioshaker (MBR-022UP, Taitec, Japón) con una velocidad de rotación de 200 rpm a 37 °C. La transferencia en serie diaria a medio fresco se realizó a tres tasas de dilución diferentes (Fig. 1A complementaria), que se estimaron de acuerdo con la tasa de crecimiento diario como se describió anteriormente78. Solo uno de los tres cultivos en los que el crecimiento celular estaba dentro de la fase exponencial (p. ej., ~107 células/mL) se usó para la siguiente transferencia en serie. Tenga en cuenta que la concentración celular inicial de la transferencia diaria fue superior a 104 células/mL, para evitar la deriva genética. Los seis linajes se generaron de forma independiente para evitar la contaminación cruzada. Todos los cultivos celulares diarios se sembraron con glicerol al 15 % a -80 °C.

Las poblaciones de células de E. coli se analizaron utilizando un citómetro de flujo de imágenes Amnis™ ImageStream™X instalado con el software de adquisición INSPIRE (Luminex, EE. UU.). La fluorescencia verde se indujo con un láser de 200 mW y 488 nm y la emisión se detectó con un filtro de 505–560 nm en el canal 2. Los datos de campo claro se recolectaron en el canal 4, la dispersión lateral (SSC) se produjo con un 2 mW 785 láser nm, y las emisiones se recolectaron en el canal 6 con un filtro de 745–800 nm. Las imágenes se adquirieron con un aumento de 60 veces, un tamaño de píxel de 0,09 μm2, un caudal bajo y una alta sensibilidad. Los reactivos de calibración SpeedBead (400041, Luminex, EE. UU.) se usaron para la calibración diaria como perlas internas y se ejecutaron simultáneamente para la detección de velocidad en tiempo real y el enfoque automático. Los cultivos celulares se diluyeron con medio fresco de 1 a 100 veces para medirlos con un citómetro de flujo de imágenes. Se adquirieron y seleccionaron aproximadamente 10 000 células (puntos de datos) (Fig. 1B complementaria) de acuerdo con la intensidad de fluorescencia y la intensidad de la relación de aspecto de fluorescencia para excluir las perlas internas y los restos de cultivo celular con el software IDEAS (v.6.2.183.0, Luminex, EE. UU. ).

Las celdas (puntos de datos) utilizadas para el análisis de morfología se seleccionaron aún más (Fig. 1B complementaria) de acuerdo con la calidad de nitidez de las imágenes de las celdas, es decir, el gradiente de fluorescencia RMS (raíz cuadrática media para la nitidez de la imagen), como se describió anteriormente79. Solo las imágenes de celdas enfocadas se usaron para el análisis. Las longitudes y anchuras relativas de las celdas se representaron mediante las longitudes de los ejes mayor y menor, que eran las dimensiones más largas y más estrechas de la imagen de la celda, respectivamente. La forma de la celda estaba representada por la relación de aspecto, que era la longitud del eje menor dividida por la longitud del eje mayor e indicaba la esfericidad de la celda en la imagen. El tamaño relativo de la celda estuvo representado por dos características: área y volumen. El área relativa de la celda (A) fue el total de píxeles de la imagen de la celda, y el volumen relativo de la celda (V) se calculó de acuerdo con la longitud relativa (L) y el ancho (W) de las celdas con la siguiente fórmula (Ec. 1 ), como se informó anteriormente80.

Las células de E. coli se inocularon a partir de soluciones madre de glicerol en tubos de ensayo que contenían 3 ml de medio mínimo 3,5 mM suplementado con OAV o 10,5 mM suplementado con glucosa y se incubaron en un bioagitador (MBR-022UP, Taitec, Japón) a 200 rpm y 37ºC. °C como precultivos. Posteriormente, los precultivos se transfirieron a 3 ml de medio mínimo fresco que se suministró con OAV 0,035, 0,07, 0,35, 0,7 o 3,5 mM o glucosa 0,105, 0,21, 1,05, 2,1 o 10,5 mM, respectivamente, a una tasa de dilución común de 1000 veces. Cada 10 probetas de cultivos paralelos se aplicaron para cada concentración (un total de 10 concentraciones). Los cambios en la concentración celular, morfología, fluorescencia, etc., se evaluaron con un citómetro de flujo de imágenes a intervalos de varias horas hasta que el cultivo celular alcanzó la fase estacionaria. La capacidad de utilización se definió como los valores medios (N > 5) de la concentración celular máxima (células/mL), que se calcularon de acuerdo con las mediciones temporales, divididos por las concentraciones (mM) de la fuente de carbono suministrada, es decir, OAV. o glucosa. Se midieron las densidades de población estables y las concentraciones de células por mM de fuente de carbono se calcularon como la capacidad de población. Los resultados se resumieron en Datos complementarios 6.

Las células de E. coli se inocularon a partir de stocks de glicerol en tubos de ensayo que contenían 3 ml de medio mínimo suplementado con glucosa 10,5 mM y se incubaron en un bioagitador (MBR-022UP, Taitec, Japón) a 200 rpm y 37 °C como precultivos. Los precultivos se diluyeron 1000 veces con medio mínimo fresco suministrado con glucosa 0,105, 0,21, 1,05, 2,1 o 10,5 mM y posteriormente se cargaron en microplacas de 96 pocillos de fondo plano (Corning, EE. UU.) en seis pocillos con ubicaciones variadas según la condición de cultivo , como se ha descrito anteriormente77. Las microplacas se incubaron en un lector de placas (Synergy H1, BioTek, EE. UU.) con agitación orbital continua a 282 cpm y 37 °C. El crecimiento se controló midiendo la absorbancia a 600 nm y las lecturas se obtuvieron a intervalos de 30 min durante 20-30 h. La tasa de crecimiento se calculó de acuerdo con los cambios en la DO600, como se describió anteriormente81.

Las células de E. coli se fijaron con glutaraldehído al 2,5 %, seguido de un tratamiento con OsO4 al 1 % durante 1 hora a 4 °C. Luego, las células se enjuagaron con PBS (solución salina tamponada con fosfato) tres veces, se deshidrataron en una serie graduada (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 %) de etanol, se secaron con una temperatura crítica. secador puntual (Leica EM CPD 300, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania), y recubierto con oro en un recubridor por pulverización catódica (ACE600, Leica Microsystems). Las muestras preparadas se observaron utilizando un microscopio electrónico de barrido (Hitachi S-4800, Japón) a un voltaje de aceleración de 3 kV.

Las células de E. coli cultivadas en medio mínimo suplementado con glucosa se recolectaron en la fase estacionaria para el análisis de mutación del genoma, como se describió anteriormente63. La resecuenciación del genoma fue realizada por Sangon (Shanghai, China). El ADN genómico se extrajo con un kit Magen Bacterial DNA KF (Sangon, Shanghái, China) y las bibliotecas de gDNA se construyeron con el NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit para Illumina (NEB, EE. UU.). La resecuenciación del genoma completo se realizó con las plataformas NovaSeq 6000 (Illumina, San Diego, CA) y MGISEQ-2000 (MGI, Shenzhen, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las lecturas se asignaron a la secuencia de referencia (número de acceso de NCBI NC_020518.1) y las mutaciones del genoma, es decir, SNP e indels, se determinaron con Genome Analysis Toolkit (GATK). Los conjuntos de datos RAW se depositaron en BioProject con el número de acceso PRJNA693085 (SRR13487015-SRR13487022).

Todos los experimentos biológicos se realizaron repetidamente (N = 5-12). Todos los análisis fueron sometidos a la evaluación estadística (N > 4) para sacar la conclusión. Los detalles se describieron en las secciones correspondientes de experimentos y análisis. Los conjuntos de datos adquiridos de los experimentos repetidos y utilizados para los análisis estadísticos se proporcionan como datos complementarios como referencia.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación del genoma están depositados en BioProject con número de acceso PRJNA693085. Los datos de origen utilizados para los análisis y para generar las cifras están disponibles en los Datos complementarios 1–6. Otros datos están disponibles del autor correspondiente a petición razonable.

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Los autores agradecen a Yiwen Wang y Zhiwei Gong en el Centro de Microscopía Electrónica de la Plataforma Multifuncional para la Innovación ECNU (004) por ayudar con las micrografías electrónicas. La investigación fue apoyada por el Programa Nacional Clave de I+D de China, Investigación de Biología Sintética (2019YFA0904500) y el Laboratorio Conjunto Internacional de Software Confiable del MOE en ECNU y fue apoyada parcialmente por JSPS KAKENHI, Subvención de Ayuda para Investigación Científica (B) concesión número 19H03215 (a BWY).

Centro de Investigación de Biología Sintética Biomédica, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Normal del Este de China, 3663 North Zhongshan Road, Shanghai, 200062, PR China

Hui Lu, Yang Xia, Jian Xu, Kai Li y Tetsuya Yomo

Escuela de Posgrado en Ciencias Ambientales y de la Vida, Universidad de Tsukuba, 1-1-1 Tennoudai, Tsukuba, Ibaraki, 305-8572, Japón

Honoka Aida, Masaomi Kurokawa y Bei-Wen Ying

Escuela de Ingeniería de Software, Universidad Normal de China Oriental, 3663 North Zhongshan Road, Shanghai, 200062, PR China

feng chen

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BWY y TY concibieron la investigación; BWY diseñó los experimentos; HL realizó los experimentos; HL, MK, HA y BWY analizaron los datos; MK, YX, CF, JX y LK proporcionaron las herramientas experimentales y analíticas; BWY redactó el documento y los gráficos; HL, JX, BWY y TY revisaron el documento; y todos los autores aprobaron el artículo.

Correspondencia a Bei-Wen Ying o Tetsuya Yomo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Nkrumah Grant y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Thulani Makhalanyane y Caitlin Karniski. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Lu, H., Aida, H., Kurokawa, M. et al. El mimetismo primordial induce cambios morfológicos en Escherichia coli. Comun Biol 5, 24 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02954-w

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Recibido: 15 febrero 2021

Aceptado: 07 diciembre 2021

Publicado: 11 enero 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-021-02954-w

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