Identificación de pequeñas moléculas capaces de potenciar la fusión de membranas virales | Orgullo Co., Ltd de Nanning del pavo real

Virology Journal volumen 20, Número de artículo: 99 (2023) Citar este artículo

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Se han desarrollado varios enfoques para analizar la entrada de virus altamente patógenos. En este estudio, informamos la implementación de un ensayo de Complementación multicelular bimolecular (BiMuC) para monitorear de manera segura y eficiente la fusión de membranas mediada por SARS-CoV-2 S sin la necesidad de equipos basados en microscopía. Usando BiMuC, examinamos una biblioteca de medicamentos aprobados e identificamos compuestos que mejoran la fusión de membrana celular mediada por proteína S. Entre ellos, el etinilestradiol promueve el crecimiento de los virus SARS-CoV-2 e Influenza A in vitro. Nuestros hallazgos demuestran el potencial de BiMuC para identificar moléculas pequeñas que modulan el ciclo de vida de los virus envueltos, incluido el SARS-CoV-2.

El nuevo síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2 (SARS-CoV-2) [1, 2] ha causado la enfermedad pandémica conocida como enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Esta enfermedad ha tenido y sigue teniendo un tremendo impacto en nuestros sistemas de salud y la economía global. En consecuencia, se han realizado esfuerzos extraordinarios para desarrollar medidas profilácticas y terapéuticas para reducir la morbilidad y mortalidad asociadas con la enfermedad COVID-19.

La membrana celular es la primera barrera que encuentra el virus al infectar una nueva célula. En algún momento durante la entrada, los virus envueltos deben fusionar las membranas celular y viral. En el caso del SARS-CoV-2, la proteína de pico (S) altamente glicosilada es responsable de ingresar a las células huésped [3]. La proteína S, una proteína de fusión trimérica de clase I [4], se traduce en una forma no activa (S0). La activación proteolítica de S0 por las proteasas del huésped (es decir, TMPRSS2) produce la proteína S madura de prefusión incorporada en los viriones [5]. El proceso infeccioso comienza con la unión de la proteína S a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) en la superficie celular [2, 6]. La unión a ACE2 desencadena un cambio conformacional, lo que da como resultado la exposición del péptido de fusión de la proteína S, que interactuará con la membrana del huésped e iniciará la fusión de las membranas viral y celular. Facilitar cualquiera de los múltiples pasos en este proceso complejo aceleraría y aumentaría la producción viral, acelerando el desarrollo de vacunas tradicionales, reduciendo los costos de producción y aumentando el rendimiento de fabricación [7].

Se han desarrollado múltiples enfoques para analizar de manera segura la entrada viral, incluidos ensayos basados en virus pseudotipificados, ensayos basados en partículas similares a virus, ensayos bioquímicos o ensayos de fusión célula-célula. La identificación de sincitios, debido a la expresión de la maquinaria de fusión viral y el correspondiente receptor del huésped en la superficie celular, se ha realizado tradicionalmente mediante microscopía. Sin embargo, las metodologías basadas en microscopios dificultan la cuantificación del proceso de fusión y la implementación de métodos de alto rendimiento para la identificación de moléculas pequeñas.

Para estudiar el proceso de fusión de membranas mediado por SARS-CoV-2 S, decidimos adaptar el ensayo de Complementación Bimolecular Multicelular (BiMuC) desarrollado recientemente [8]. Basado en las propiedades de complementación bimolecular de una proteína indicadora fluorescente, este ensayo facilita la identificación y cuantificación de eventos de fusión célula-célula inducidos por virus sin la ayuda de equipos basados en microscopios. Después de acomodar BiMuC para el estudio de SARS-CoV-2, configuramos una pantalla para moléculas pequeñas capaces de modular el proceso de fusión de membrana mediado por proteína S. Examinamos 1280 moléculas pequeñas, utilizando este ensayo, e identificamos que el etinilestradiol mejora la fusión de membrana celular mediada por proteína S. Como resultado, el etinilestradiol aumenta el crecimiento del SARS-CoV-2 in vitro. Además, el efecto sobre la fusión de membranas mediada por virus no se limita al SARS-CoV-2. Demostramos que el etinilestradiol podría aumentar el crecimiento del virus de la influenza A y la fusión de la membrana del virus Nipah. Nuestros resultados muestran que BiMuC podría implementarse para monitorear el proceso de fusión de membranas del SARS-CoV-2 e identificar pequeñas moléculas que perturban este proceso.

Se obtuvieron células de riñón canino Hek 293T, Vero E6 y Madin-Darby (MDCK) de ATCC (http://www.atcc.org) y se mantuvieron en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, http://www. .lifetechnologies.com) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Gibco). El plásmido SARS-CoV-2 S fue un regalo del Dr. F. Krammer (Ichan School of Medicine at Mount Sinai). Jun-Nt VFP (Jun) y Fos-Ct VFP (Fos) y los plásmidos que expresan ACE2 y TMPRSS2 humanos se obtuvieron de Addgene (#22,012, #22,013, #1786 y #53,887, respectivamente).

Para estudiar las propiedades de fusión de la membrana del SARS-CoV-2, se transfectaron células Hek 293T (DMEM suplementadas con FBS al 10 %) con polietilenimina (PEI) [9], ya sea con SARS-CoV-2 S y Jun o con ACE2 y Fos más el pRL Renilla Luciferase (Promega) para normalizar la señal. Además, probamos las combinaciones SARS-CoV-2 S-Fos y ACE2-Jun, una vez más, con la pRL Renilla Luciferase. Al día siguiente, las células se contaron, mezclaron y sembraron en placas de 96 pocillos (1 × 105 células/pocillo en 100 µl de medio). Después de 48 h, se midió la fluorescencia (λexc = 485 nm, λem = 535 nm) en placas de 96 pozos como se describió previamente [10].

Para la identificación de moléculas pequeñas con la capacidad de modular la fusión de membranas, el protocolo se ajustó para cumplir con los estándares de detección necesarios. Para evaluar la solidez de nuestro ensayo, calculamos el factor Z′ y la relación señal-ruido (S/N). Factor Z′ = 1 − ((3δpos + 3δneg)/(µpos − µneg)), donde µpos es la señal media del control positivo, µneg es la señal media del control negativo, δpos es la desviación estándar del control positivo control, y δneg es la desviación estándar para el control negativo. Brevemente, las células Hek 293T se sembraron en placas de 15 cm (5 × 106 células/placa) utilizando DMEM complementado con FBS al 10 %. Después de 24 h de incubación (37 °C, 5 % de CO2), las células se transfectaron utilizando PEI con las combinaciones de plásmido mencionadas anteriormente o se transfectaron de forma simulada. Al día siguiente, las células se contaron, mezclaron y sembraron manualmente en placas negras sólidas de 96 pocillos (1 × 105 células/pocillo en 100 µl de medio). Las células se mezclaron en 2 grupos, el grupo A contenía células que expresaban Jun y SARS-CoV-2 S o Fos y ACE2 y el grupo B con células que expresaban Jun o Fos. Los pocillos de las columnas 1 a 11 se sembraron con 50 µL de células del conjunto A, mientras que la columna 12 recibió 50 µL de células del conjunto B. A continuación, se añadieron manualmente a las células 50 µL de los compuestos pequeños a 50 µM (concentración final 25 µM , 0,25% DMSO). Utilizamos una biblioteca Prestwick Chemical (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) que contenía 1280 compuestos en placas de 96 pocillos. Las columnas 1 y 12 (controles positivo y negativo, respectivamente) se trataron con DMSO en cada placa. Después de 48 h de incubación, se sustituyó el medio por 100 µL de PBS y se midió la fluorescencia en un lector de placas múltiples VictorX (Perking Elmer, Waltham, MA, EE. UU.). Los resultados obtenidos de la pantalla se estandarizaron usando el Z-Score, calculado de la siguiente manera: Z-Score = (x − µ)/δ, donde x es la señal sin procesar, µ es la señal media y δ es la desviación estándar de todos los pocillos que contienen el compuesto de una placa. El puntaje Z indica cuántas desviaciones estándar está un compuesto en particular por encima o por debajo de la media de la placa. Los aciertos primarios se identificaron calculando una puntuación Z para cada compuesto y aplicando criterios de selección de aciertos; Puntuación Z > 1.5. Los aciertos se confirmaron en la selección secundaria. Esta vez las células incluían el pRL-Renilla. La luminiscencia se midió utilizando el kit Renilla Luciferase Assay de Sigma siguiendo el protocolo del fabricante en placas de cultivo de glóbulos blancos de 96 pocillos. Esta medida facilita la eliminación de aquellos compuestos que promueven la división celular o la supervivencia, aumentando así la señal de fluorescencia sin aumentar efectivamente la fusión célula-célula. Para descartar los aciertos que tenían propiedades fluorescentes similares a VFP, las células se sembraron en placas negras de 96 pocillos y se trataron con los compuestos en las mismas condiciones descritas anteriormente. En este caso, la fluorescencia se midió como antes (λexc = 485 nm, λem = 535 nm). En todos los ensayos, [DMSO] se mantuvo en ≤ 1 %. El análisis estadístico se realizó con Libre Office Calc.

Para estudiar el efecto sobre la fusión de membranas inducida por el virus Nipah, llevamos a cabo el ensayo BiMuC original descrito en [8]. En este caso, las células Hek 293T se transfectaron con Jun-Nt, NiV F y G o con Fos-Ct y un plásmido que codifica la luciferasa de Renilla (pRL, Promega). A continuación, los grupos de células se mezclaron y trataron con el compuesto indicado (la concentración de DMSO se mantuvo al 1%). Después de 48 h se midió la fluorescencia. Se realizaron al menos tres experimentos independientes.

La toxicidad de los compuestos se evaluó con Cell-Titer Glo (Promega) siguiendo las indicaciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron (~ 1 × 104 células/placa) en una placa blanca opaca de 96 pocillos y se trataron con el compuesto apropiado a la concentración indicada durante 48 h. A continuación, se añadieron 100 µl de reactivo CellTiter-Glo® y se dejó estabilizar la señal de luminiscencia durante 10 min. La luminiscencia se registró en un lector de placas múltiples VictorX (Perking Elmer, Waltham, MA, EE. UU.).

Las células Vero E6 se infectaron a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 con SARS-CoV-2. A continuación, se añadieron etaverina, rabeprazol o etinilestradiol a la concentración adecuada. Además, las células se trataron con DMSO. Después de 48 h, se recogieron los sobrenadantes y se titularon mediante un ensayo de placas estándar en células VeroE6. Como alternativa, las células MDCK se infectaron con IAV/WSN/33 a una MOI de 0,001. Las muestras se incubaron en ausencia o presencia de ethaverina, rabeprazol o etinilestradiol a las concentraciones indicadas durante 48 h. A continuación, se recogieron los sobrenadantes y se titularon mediante el método de dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50 % (TCID50) en células MDCK. En todos los ensayos, [DMSO] se mantuvo en ≤ 1 %.

Análisis de fusión de membranas SARS-CoV-2 por BiMuC. Una representación esquemática del ensayo BiMuC. Las proteínas Jun y Fos se fusionaron a los extremos Nt y Ct de la VFP, respectivamente, para crear las quimeras VN-Jun y VC-Fos, de ahora en adelante presentadas simplemente como Jun y Fos. La reconstitución de la estructura de VFP (representada en verde) y, por lo tanto, de sus propiedades de fluorescencia, ocurre exclusivamente después de la interacción de Jun y Fos. Cuando las quimeras VN-Jun y VC-Fos se expresan en grupos de células separados, no es posible la reconstitución (izquierda). La fusión de membranas del SARS-CoV-2 se basa en la interacción exitosa entre el SARS-CoV-2 S y la ACE2 humana. La expresión de estas dos proteínas en la superficie de dos células adyacentes conduce a la fusión de las membranas celulares y a la creación de un sincitio (centro). Cuando las células que se fusionan portan las quimeras VN-Jun y VC-Fos pueden reconstituir la estructura nativa de VFP (representada en verde, a la izquierda). Por el contrario, la inhibición de cualquiera de los procesos celulares o virales que conducen a la fusión de membranas, desde la síntesis y maduración de la proteína S hasta su interacción con ACE2, dará como resultado la ausencia de señal fluorescente. B Para el ensayo de fusión célula-célula, se transfectaron células Hek 293T con las combinaciones de plásmidos indicadas. Es decir: Jun + SARS-CoV-2 S, Fos + hACE2, Jun + hACE2, Fos + SARS-CoV-2 S, Jun + Fos, Jun, Fos, SARS-CoV-2 S, hACE2, Fos + hACE2 + TMPRSS2. Al día siguiente, se contaron las células de cada conjunto de células y se mezclaron como se indica. Después de 48 h, se midió la fluorescencia. Se representan la media y la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes (n valores 7, 6, 6, 6, 3, 3, respectivamente). Un punto sólido representa el valor individual de cada experimento. Las barras verdes indican aquellas muestras con niveles de fluorescencia comparables al control positivo (Jun-Fos). Las diferencias estadísticas se basan en una prueba t homoscedástica de dos colas (los valores p se indican encima de la barra correspondiente, ns no significativo)

El nuevo SARS-CoV-2 es un agente altamente contagioso. En consecuencia, su manejo requiere importantes medidas de seguridad, lo que puede complicar los protocolos de investigación. Para facilitar el estudio del proceso de fusión de membranas mediado por SARS-CoV-2 S, decidimos implementar un ensayo de complementación basado en fluorescencia [8]. El enfoque BiMuC es un enfoque seguro y libre de virus basado en las propiedades estructurales de algunas proteínas fluorescentes, como la proteína fluorescente de Venus (VFP) [10,11,12,13]. Brevemente, el VFP se puede dividir en dos fragmentos (VN y VC, respectivamente), ninguno de los cuales es fluorescente por sí mismo. Sin embargo, si estos dos fragmentos se fusionan con un par de proteínas que interactúan y los unen, se reconstituye la estructura nativa de la VFP y se recuperan sus propiedades de fluorescencia. Las quimeras se expresan en grupos de células separadas junto con la maquinaria viral requerida para la fusión de membranas. Si la fusión de membranas acerca las quimeras fluorescentes, la fluorescencia se reconstituiría. Por el contrario, no se recuperaría ninguna señal si no se cumplieran las condiciones para formar un sincitio (Fig. 1A).

Identificación de moléculas pequeñas. Una representación esquemática del ensayo BiMuC utilizado para la identificación de moléculas pequeñas con propiedades de mejora de la fusión de membranas. B Representación del flujo de trabajo de la pantalla de moléculas pequeñas y validación de los aciertos resultantes

Para probar si podíamos aplicar esta metodología al estudio de la fusión de membranas inducida por SARS-CoV-2, los socios interactivos c-Jun y c-Fos [14] se vincularon a los fragmentos VN y VC de VFP, generando la c -Quimeras Jun/VN y c-Fos/VC, en adelante presentadas simplemente como Jun y Fos. Estas quimeras se expresaron en dos grupos de células independientes con SARS-CoV-2 S (Jun-S) y ACE2 (Fos-ACE2), respectivamente. Además, incluimos células transfectadas con Jun y Fos juntos (Jun-Fos), Jun, Fos, S, ACE2 o un plásmido vacío (Empty) en el ensayo. Después de la transfección, los grupos de células se combinaron como se indica y se incubaron durante 48 h adicionales (Fig. 1B). Las muestras que contenían células transfectadas con Jun-S y Fos-ACE2 mostraron una señal de fluorescencia significativamente más fuerte que aquellas que combinaron grupos de células que expresaban Jun y Fos o S y ACE2 (controles negativos), lo que sugiere que una fusión exitosa de las membranas celulares desencadenada por la la maquinaria viral reunió a las dos quimeras y facilitó la reconstitución de la señal fluorescente (Fig. 1B). Tenga en cuenta que también probamos las combinaciones Jun-ACE2 y Fos-S. Nuestros datos sugieren que la metodología BiMuC podría implementarse para estudiar de forma segura la fusión de membranas mediada por SARS-CoV-2. Las imágenes de sincitios inducidos por SARS-CoV-2 S se pueden encontrar en la Fig. 1 complementaria.

La identificación de moléculas pequeñas que influyen en el ciclo de vida viral a menudo requiere protocolos de detección de alto rendimiento (HTS) escalables y sólidos. Estos procedimientos también deberían ser seguros en el caso de virus altamente patógenos, como el SARS-CoV-2. Para demostrar que el ensayo SARS-CoV-2 BiMuC podría usarse en condiciones de alto rendimiento, configuramos un ensayo para identificar moléculas pequeñas que influyen en el proceso de fusión de membranas mediado por SARS-CoV-2 S. Estábamos particularmente interesados en moléculas pequeñas que pudieran mejorar la entrada viral. A pesar de la introducción de nuevas plataformas de vacunas, la producción de vacunas a menudo depende de la producción de grandes cantidades de virus. En consecuencia, se han implementado varias estrategias para aumentar la producción viral, desde la selección de células hasta la optimización de los procedimientos de replicación [15,16,17]. Una molécula capaz de facilitar la fusión de la membrana viral, teóricamente, mejoraría el crecimiento viral y podría usarse para facilitar la producción de vacunas tradicionales [7].

Nuestro ensayo se basa en células Hek 293T, que expresan niveles bajos de ACE2 y TMPRSS2 [18, 19]. Si bien ACE2 se complementó en trans, intencionalmente no incluimos TMPRSS2 en nuestro ensayo para establecer un estado de fusión subóptimo que facilita la identificación de moléculas pequeñas que mejoran la formación de sincitios. Acelerar o aumentar la producción de virus aceleraría el desarrollo de vacunas, reduciría los costos de producción y aumentaría el rendimiento de fabricación [20]. Para confirmar que nuestro ensayo puede identificar un aumento en la fusión viral, incluimos TMPRSS2 en la mezcla de transfección con ACE2 (Fos-ACE2-TMPRSS2). Como era de esperar, la adición de esta serina proteasa aumentó la señal fluorescente observada (Fig. 1B). Estos resultados confirman que nuestra configuración podría identificar compuestos que mejoran la fusión de la membrana viral y celular.

A continuación, adaptamos nuestra metodología para el HTS de moléculas pequeñas y verificamos su idoneidad por el factor Z′ (0,63 o 0,62 para las combinaciones Jun-S + Fos-ACE2 o Jun-ACE2 + Fos-S, respectivamente) [21]. Brevemente, las células Hek 293T se transfectaron con Jun-S o Fos-ACE2 más un plásmido que codifica la luciferasa de Renilla bajo un promotor constitutivo. Después de la transfección, los grupos de células se mezclaron como se describe anteriormente, se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con la molécula pequeña apropiada. Cada placa incluía una columna de pocillos tratados con DMSO. Además, las placas incluían 8 pocillos como control negativo que contenía células transfectadas con Jun o Fos (ambas agrupaciones de células se combinaron como antes) y se trataron con DMSO. Una vez tratadas, las células se incubaron durante 48 h, seguido de medición de fluorescencia y selección de aciertos (Fig. 2A).

Análisis de compuestos de impacto. A–F Los compuestos seleccionados se recompraron y su capacidad para aumentar la formación de sincitios se probó con el ensayo BiMuC. Brevemente, las células Hek293T se transfectaron con proteínas Jun más SARS-CoV 2 S e independientemente con Fos y ACE2 humano. Después de 24 h, las muestras se combinaron y trataron con el compuesto apropiado a la concentración indicada o se trataron de forma simulada durante 48 h. A continuación, se calculó la fluorescencia, indicativa del porcentaje de fusión. Se representan los porcentajes de fluorescencia sobre las muestras tratadas de forma simulada (DMSO). Se muestran el promedio y la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Los puntos representan experimentos individuales. Sobre la base de una prueba t homoscedástica de una cola, se calcularon las diferencias estadísticas entre las muestras tratadas con compuesto y simuladas. El valor p se muestra cuando se encuentran diferencias significativas

Se seleccionó una biblioteca que constaba de 1280 moléculas pequeñas químicamente diversas (Prestwick Chemical, GreenPharma) y los resultados se estandarizaron mediante el Z-Score; Se seleccionaron 76 aciertos principales en función de un Z-Score> 1.5 (Tabla S1). Los aciertos se volvieron a analizar utilizando las mismas condiciones experimentales y criterios de selección. Solo se consideraron los compuestos capaces de potenciar la fusión viral en ambas rondas (Fig. 2B). Además, medimos la luminiscencia de la luciferasa de Renilla y eliminamos aquellos compuestos que promueven la división celular o la supervivencia, aumentando así la señal de fluorescencia sin aumentar efectivamente la fusión célula-célula. También probamos las propiedades de fluorescencia de los éxitos restantes y descartamos aquellos compuestos que emitían cerca de 530 nm (Fig. 2B).

Se seleccionaron un total de 6 compuestos; estos se volvieron a comprar a un proveedor diferente y se volvieron a analizar en concentraciones múltiples para confirmar su capacidad para mejorar la fusión de la membrana viral en Hek 293T. Los compuestos se incubaron durante 48 o 72 h (Figs. 3 y 4). Observamos un aumento modesto en la fusión de membrana inducida por virus cuando los compuestos se incubaron durante 48 h; latanoprost, simvastatina y etinilestradiol fueron los inductores más potentes. Sin embargo, después de 72 h de incubación, la mayoría de los compuestos (excepto diperodon) aumentan la señal de fluorescencia. Se observó una respuesta a la dosis limitada cuando los compuestos se incubaron durante 48 h. Sin embargo, se observó una mayor dependencia de la dosis a las 72 h después del tratamiento.

Análisis de compuestos de impacto tras 72 h de incubación. A–F La capacidad de los compuestos seleccionados para aumentar la formación de sincitios se probó con el ensayo BiMuC en células Hek293T. Brevemente, las células Hek293T se transfectaron con proteínas Jun más SARS-CoV 2 S e independientemente con Fos y ACE2 humano. Después de 24 h, las muestras se combinaron y trataron con el compuesto apropiado a la concentración indicada o se sometieron a un tratamiento simulado durante 72 h. Se representan los porcentajes de fluorescencia sobre las muestras tratadas de forma simulada (DMSO). Se muestran el promedio y la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Los puntos representan experimentos individuales. Sobre la base de una prueba t homoscedástica de una cola, se calcularon las diferencias estadísticas entre las muestras tratadas con compuesto y simuladas. Cuando las diferencias son significativas, se muestra el valor p

Análisis de compuestos hit en presencia de TMPRSS2. A–F La capacidad de los compuestos seleccionados para aumentar la formación de sincitios en presencia de TMPRSS2 se probó con el ensayo BiMuC. Las células Hek293T se transfectaron con TMPRSS2 junto con la maquinaria viral y celular requerida para la formación de sincitios. A continuación, las células se mezclaron y trataron con el compuesto apropiado durante 48 h. Se representan los porcentajes de fluorescencia sobre las muestras tratadas de forma simulada (DMSO). Se muestran el promedio y la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Los puntos representan experimentos individuales. Sobre la base de una prueba t homoscedástica de una cola, se calcularon las diferencias estadísticas entre las muestras tratadas con compuesto y simuladas. Cuando las diferencias son significativas, se muestra el valor p

A continuación, para identificar si los compuestos seleccionados podrían inducir un aumento en la fusión viral en condiciones óptimas de crecimiento, los probamos en presencia de TMPRSS2 después de 48 h de incubación. En este caso, el efecto potenciador de los compuestos fue sustancialmente más fuerte que sin la proteasa (Fig. 5). Cabe destacar que una vez que se añadió la proteasa, se observó una respuesta dependiente de la concentración.

También analizamos la toxicidad de estos 6 compuestos midiendo el contenido de ATP en las células (Fig. 6). En las células Hek 293T, los seis compuestos demostraron cierta toxicidad a altas concentraciones. Curiosamente, a pesar de la toxicidad a estas concentraciones, observamos un aumento en la fusión célula-célula. La CC50 y la actividad de fusión célula-célula a esta concentración se muestran en la Tabla 1; la columna de la izquierda resalta un índice de actividad (el porcentaje de fusión célula-célula dividido por el CC50). Además, se probó la toxicidad del etinilestradiol en presencia de TMPRSS2 (Fig. S2). Los resultados indican que la toxicidad del compuesto no se vio afectada por la presencia de la proteasa celular. También analizamos la toxicidad de estos compuestos en células Vero, una línea celular ampliamente utilizada para cultivar virus in vitro con fines vacunales [15] (Fig. 6). En esta línea celular, la simvastatina (CC50 ~ 6 µM) mostró claramente una toxicidad superior al resto de los compuestos. Con base en estos resultados (efectividad y toxicidad), decidimos centrarnos en la ethaverina, el rabeprazol y el etinilestradiol a partir de este momento.

Toxicidad de los compuestos de impacto. A, B Se analizó la toxicidad en células Hek 293T y Vero E6 (A y B, respectivamente) después de incubar los compuestos a la concentración indicada durante 48 h. La toxicidad se analizó midiendo los niveles de ATP mediante el ensayo Cell-Titer Glo (Promega) siguiendo las indicaciones del fabricante. Los puntos representan el promedio de al menos tres experimentos independientes. C Los valores CC10, CC50 y CC90 se calcularon con los datos que se muestran en los paneles A y B

Para analizar más a fondo el papel de los compuestos seleccionados (etinilestradiol, ethaverina y rabeprazol) en la entrada de virus con envoltura, dirigimos nuestra atención al virus Nipah (NiV). NiV, miembro de la familia Paramyxoviridae, requiere dos proteínas para llevar a cabo la fusión de las membranas viral y celular, la glicoproteína (G) que se une a una proteína receptora en la superficie de la célula receptora y la proteína de fusión (F) que a su vez forzará la fusión de las membranas celular y viral. NiV es un agente restringido BSL4. Por lo tanto, para probar el efecto del etinilestradiol, la ethaverina y el rabeprazol, utilizamos el ensayo BiMuC adaptado al estudio de la entrada de NiV [8]. Nuestros resultados indican, una vez más, que estos tres compuestos pueden mejorar la fusión de membranas mediada por virus de una manera levemente dependiente de la dosis (Fig. 7).

Efecto del etinilestradiol, la ethaverina y el rabeprazol en la fusión de la membrana del virus Nipah. Para ensayar el efecto de etinilestradiol, etaverina y rabeprazol sobre la fusión de membrana de NiV, se transfectaron células Hek 293T con plásmidos que codifican NiV F, G y Jun o con Fos. Aproximadamente 24 h más tarde, se mezclaron los grupos de células y se añadió el compuesto apropiado a las concentraciones indicadas. Después de 48 h, se midió la fluorescencia. Las barras muestran el promedio y la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Los datos se presentan como pliegues sobre las muestras tratadas de forma simulada. Fos). Sobre la base de una prueba t homoscedástica de una cola (los valores p se indican encima de la barra correspondiente, ns no significativo), se calcularon las diferencias estadísticas entre las muestras tratadas con compuesto y simuladas. Cuando las diferencias fueron significativas, se indicó el valor de p

Nuestro ensayo se basa en la formación de sincitios, que podría no recapitular con precisión la fusión de las membranas viral y celular durante una infección. En consecuencia, en este punto, decidimos analizar el efecto de los compuestos afectados sobre el crecimiento viral del SARS-CoV-2 [18, 22, 23]. Nuestros resultados indicaron que el rabeprazol y el etinilestradiol aumentaron los títulos virales a las 48 h posteriores a la infección en concentraciones por debajo del CC50 (Fig. 8A), aunque no se encontraron diferencias significativas entre las muestras tratadas y no tratadas. Por otro lado, la ethaverina no aumentó ni aceleró el crecimiento del SARS-CoV-2 (Fig. 8A).

Efecto de compuestos seleccionados sobre SARS-CoV-2 e IAV. Se cultivó un SARS-CoV-2 a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 en células Vero E6 durante 48 h en ausencia o presencia de ethaverina, rabeprazol o etinilestradiol en las concentraciones indicadas. A continuación, se recogieron los sobrenadantes y se titularon mediante un ensayo de placas estándar en células Vero E6. Las barras muestran las unidades formadoras de placas (pfu) promedio y la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Los puntos representan experimentos individuales. No se encontraron diferencias estadísticas, basadas en una prueba t homocedástica de dos colas, entre las muestras tratadas y las tratadas de forma simulada. B IAV/WSN/33, a una MOI de 0,001, se usó para infectar células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). El IAV se incubó en ausencia o presencia de ethaverina, rabeprazol o etinilestradiol a las concentraciones indicadas durante 48 h. A continuación, se recogieron los sobrenadantes y se valoraron mediante el método de dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50 % (TCID50) en células MDCK. Las barras muestran las unidades formadoras de placas (pfu) promedio y la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Los puntos representan experimentos individuales. Según una prueba t homocedástica de dos colas, no se encontraron diferencias estadísticas entre las muestras tratadas y las tratadas de forma simulada.

A continuación, analizamos si la capacidad de estos compuestos para mejorar el crecimiento viral estaba restringida al SARS-CoV-2. Para ello, probamos el efecto de la ethaverina, el rabeprazol y el etinilestradiol sobre el crecimiento del virus de la influenza A (IAV). IAV causa morbilidad y mortalidad anual sustancial con brotes epidémicos estacionales. Las epidemias de influenza estacional pueden controlarse mediante la vacunación, y anualmente se distribuyen ampliamente vacunas polivalentes que contienen IAV y componentes del virus de la influenza B. Al igual que el SARS-CoV-2, el IAV es un virus envuelto que se basa en una proteína de fusión de clase I, la proteína hemaglutinina (HA), para la fusión de las membranas viral y celular.

Infecciones por IAV que llevamos a cabo en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) en presencia y ausencia de los compuestos seleccionados [24]. Nuestros resultados indican que el etinilestradiol aumenta los títulos de IAV en aproximadamente un logaritmo (Fig. 8B), aunque no se encontraron diferencias significativas. Por otro lado, la ethaverina y el rabeprazol no aumentaron los títulos virales (Fig. 8B).

La mayoría de los compuestos incluidos en la biblioteca química utilizada en nuestra pantalla son medicamentos aprobados y actualmente se utilizan en varios tratamientos. Sin embargo, es importante tener en cuenta que nuestros experimentos son insuficientes para afirmar que los compuestos afectados, incluido el etinilestradiol, podrían empeorar el resultado de un paciente durante la infección con un virus envuelto.

En resumen, nuestros resultados sugieren que el etinilestradiol podría usarse in vitro para mejorar el crecimiento de los virus con envoltura. Según trabajos anteriores [25,26,27,28,29], el etinilestradiol podría alterar las propiedades de las membranas viral y celular para facilitar la fusión de membranas o la endocitosis viral. Los compuestos como el polibreno se utilizan para mejorar las infecciones por retrovirus al facilitar la adhesión de los viriones a la superficie celular, ya que la adición de policationes cargados positivamente reduce las fuerzas de repulsión entre la célula y el virus, lo que mejora la eficiencia de la transducción [30]. Sin embargo, que sepamos, no se han identificado previamente compuestos que mejoren la fusión de membranas y, posteriormente, aumenten y aceleren el crecimiento viral.

Nuestros resultados demuestran que BiMuC se puede implementar para monitorear el proceso de fusión de membranas SARS-CoV-2. Además, mostramos que esta metodología es adecuada para la identificación de alto rendimiento de pequeñas moléculas que influyen en la entrada viral de algunos virus envueltos y, por lo tanto, el crecimiento viral.

Todos los datos del estudio se incluyen en el artículo y/o en la información complementaria.

Wu F, Zhao S, Yu B, Chen YM, Wang W, Song ZG, et al. Un nuevo coronavirus asociado con enfermedades respiratorias humanas en China. Naturaleza. 2020;579:265–9.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. Un brote de neumonía asociado a un nuevo coronavirus de probable origen murciélago. Naturaleza. 2020;579:270–3.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim D, Lee JY, Yang JS, Kim JW, Kim VN, Chang H. La arquitectura del transcriptoma del SARS-CoV-2. Celúla. 2020;181:914–921e10.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wrapp D, Wang N, Corbett KS, Goldsmith JA, Hsieh CL, Abiona O, et al. Estructura crio-EM del pico 2019-nCoV en la conformación de prefusión. Ciencia. 2020;367:1260–3.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang H, Rao Z. Biología estructural del SARS-CoV-2 e implicaciones para el desarrollo terapéutico. Nat Rev Microbiol. 2021;19:685–700.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang Q, Zhang Y, Wu L, Niu S, Song C, Zhang Z, et al. Base estructural y funcional de la entrada de SARS-CoV-2 mediante el uso de ACE2 humano. Celúla. 2020;181:894–904e9.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rando HM, Lordan R, Lee AJ, Naik A, Wellhausen N, Sell E, et al. Aplicación de Estrategias de Desarrollo de Vacunas tradicionales al SARS-CoV-2. mSistemas. Volumen 0. Sociedad Americana de Microbiología; 2023. págs. e00927–22.

García-Murria MJ, Expósito-Domínguez N, Duart G, Mingarro I, Martinez-Gil L. Un sistema de complementación multicelular bimolecular para la detección de la formación de sincitios: una nueva metodología para la identificación de inhibidores de la entrada del virus Nipah. virus 2019;11.

Islam MA, Park TE, Singh B, Maharjan S, Firdous J, Cho MH, et al. Principales policationes degradables como transportadores de ADN y siRNA. J Control Liberar Off J Control Liberar Soc. 2014; 193: 74–89.

Artículo CAS Google Académico

Grau B, Javanainen M, García-Murria MJ, Kulig W, Vattulainen I, Mingarro I, et al. El papel de la coincidencia hidrofóbica en el empaquetamiento de la hélice transmembrana en las células. Estrés celular. 2017;1:90–106.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Kerppola TK. Diseño e implementación de ensayos de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) para la visualización de interacciones de proteínas en células vivas. Protocolo Nat. 2006; 1:1278–86.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Magliery TJ, Wilson CGM, Pan W, Mishler D, Ghosh I, Hamilton AD, et al. Detección de interacciones proteína-proteína con una trampa de reensamblaje de fragmentos de proteína fluorescente verde: alcance y mecanismo. J Am Chem Soc. 2005; 127: 146–57.

Artículo CAS PubMed Google Académico

García-Murria MJ, Duart G, Grau B, Diaz-Beneitez E, Rodríguez D, Mingarro I, et al. Viral Bcl2s’ transmembrane domain interact with host Bcl2 proteins to control cellular apoptosis. Nat Commun. 2020;11:6056.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

van Dam H, Castellazzi M. Funciones distintas de Jun: Fos y Jun: dímeros ATF en la oncogénesis. Oncogén. 2001;20:2453–64.

Artículo PubMed Google Académico

Barrett PN, Terpening SJ, Snow D, Cobb RR, Kistner O. Tecnología de células Vero para el desarrollo rápido de vacunas de virus completo inactivado para enfermedades virales emergentes. Expert Rev Vacunas. 2017;16:883–94.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kiesslich S, Kamen AA. Desarrollo de bioprocesos upstream de células Vero para la producción de vectores virales y vacunas. Avanzado en biotecnología 2020;44:107608.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tapia F, Vázquez-Ramírez D, Genzel Y, Reichl U. Biorreactores para alta densidad celular y cultivos continuos en varias etapas: opciones para la intensificación de procesos en la producción de vacunas virales basadas en cultivos celulares. Aplicación Microbiol Biotechnol. 2016;100:2121–32.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Matsuyama S, Nao N, Shirato K, Kawase M, Saito S, Takayama I, et al. Aislamiento mejorado de SARS-CoV-2 por células que expresan TMPRSS2. Proc Natl Acad Sci US A. 2020;117:7001–3.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Krüger N, Herrler T, Erichsen S, et al. La entrada de células SARS-CoV-2 depende de ACE2 y TMPRSS2 y está bloqueada por un inhibidor de proteasa clínicamente probado. Celúla. 2020;181:271–280e8.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fang Z, Lyu J, Li J, Li C, Zhang Y, Guo Y et al. Aplicación de la tecnología de biorreactores para la producción de vacunas virales basadas en cultivos celulares: estado actual y perspectivas futuras. Frente Bioeng Biotechnol [Internet]. 2022 [citado el 20 de septiembre de 2022];10. Disponible en: https://www.frontiersin.org/articles/https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.921755.

Zhang J, Chung T, Oldenburg K. Un parámetro estadístico simple para usar en la evaluación y validación de ensayos de detección de alto rendimiento. Pantalla J Biomol. 1999; 4:67–73.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Caso JB, Bailey AL, Kim AS, Chen RE, Diamond MS. Crecimiento, detección, cuantificación e inactivación de SARS-CoV-2. Virología. 2020;548:39–48.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zaliani A, Vangeel L, Reinshagen J, Iaconis D, Kuzikov M, Keminer O, et al. Detección de SARS-CoV-2 citopático en células VERO-E6 en un esfuerzo de reutilización a gran escala. Grupo editorial Sci Data Nature. 2022;9:4

CAS Google Académico

Martinez-Gil L, Alamares-Sapuay JG, Ramana Reddy MV, Goff PH, Premkumar Reddy E, Palese P. Un inhibidor de múltiples quinasas de molécula pequeña reduce la replicación del virus de la influenza a al restringir la síntesis de ARN viral. Res. antivirales. 2013;100:29–37.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bossard R, Stieger B, O'Neill B, Fricker G, Meier PJ. El tratamiento con etinilestradiol induce múltiples alteraciones del transporte de la membrana canalicular en el hígado de rata. J Clin Invest. 1993;91:2714–20.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cuevas MJ, Mauriz JL, Almar M, Collado PS, González-Gallego J. Efecto del epomediol sobre los cambios inducidos por el etinilestradiol en el metabolismo de los ácidos biliares y el colesterol en ratas. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2001;28:637–42.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Elias E, Iqbal S, Knutton S, Hickey A, Coleman R. Aumento de la permeabilidad de las uniones estrechas: un posible mecanismo de colestasis estrogénica. Eur J Clin Invest. 1983; 13:383–90.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Miccio M, Orzes N, Lunazzi GC, Gazzin B, Corsi R, Tiribelli C. Reversión de la colestasis inducida por etinilestradiol por epomediol en rata. El papel de la fluidez de la membrana plasmática del hígado. Biochem Pharmacol. 1989;38:3559–63.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Van Dyke RW, raíz KV. El etinilestradiol disminuye la acidificación de las vesículas endocíticas del hígado de rata. Hepatol Baltim Md. 1993;18:604–13.

Google Académico

Cornetta K, Anderson WF. El sulfato de protamina como alternativa eficaz al polibreno en la transferencia de genes mediada por retrovirus: implicaciones para la terapia génica humana. Métodos J Virol. 1989; 23: 187–94.

Artículo CAS PubMed Google Académico

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Este trabajo ha sido subvencionado por la Generalitat Valenciana (PROMETEO/2019/065) y subvención PID2020-119111GB-I00 por MCIN/AEI/10.13039/501100011033. OZ está financiado por la subvención PID2020-114546RB de MCIN/AEI/10.13039/501100011033. LG es beneficiaria de un contrato predoctoral (CIACIF/2021/119) de la Generatitat Valenciana. MR-S es beneficiario de un contrato predoctoral del Ministerio de Ciencia e Innovación de España (PRE2021-101042 by MCIN/AEI/10.13039/501100011033). Esta publicación también fue apoyada por el proyecto European Virus Archive GLOBAL (EVA-GLOBAL) que ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención 871029.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Instituto Universitario de Biotecnología y Biomedicina (BIOTECMED), Universidad de Valencia, Burjassot, E-46100, Spain

Mª Jesús García-Murria, Laura Gadea-Salom, Marina Rius-Salvador, Ismael Mingarro & Luis Martínez-Gil

Centro de Investigación en Sanidad Animal, CISA (Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria/Consejo Superior de Investigaciones Científicas (INIA/CSIC)), Madrid, Spain

Sandra Moreno & Alejandro Brun

Laboratorio de Referencia de Micología, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, España

Oscar Zaragoza

Centro de Investigación Biomédica en Red en Enfermedades Infecciosas (CIBERINFEC, Instituto de Salud Carlos III, CB21/13/00105), Madrid, España

Oscar Zaragoza

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investigación diseñada por MJGM, OZ, AB, IM y LMG; MJGM, LGS, SM, MRS y LMG realizaron investigaciones; MJGM, AB, IM y LMG analizaron datos; LMG escribió el artículo.

Correspondencia a Luis Martínez-Gil.

La Universidad de Valencia ha presentado una solicitud de patente relacionada con el uso de etinilestradiol para aumentar el crecimiento viral.

No aplica.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

A continuación se muestra el enlace al material complementario electrónico.

. Sincitios inducidos por la proteína SARS-CoV-2 S. Las células Hek 293T se transfectaron con proteína SARS-CoV-2 S y plásmidos codificantes de ACE2 humanos (AC) o se transfectaron de forma simulada (D). Después de 24 horas, las células se visualizaron utilizando un microscopio Motic AE200 con un objetivo de 10x.

Toxicidad por etinilestradiol en presencia de TMPRRS2. A y B. Para analizar el efecto de TMPRSS2 sobre la toxicidad del etinilestradiol, se transfectaron células Hek 293T con TMPRR22 o eYFP y 48 horas más tarde se analizó la toxicidad. La toxicidad se analizó midiendo los niveles de ATP mediante el ensayo Cell-Titer Glo (Promega) siguiendo las indicaciones del fabricante. Los puntos representan el promedio de dos experimentos independientes. Los valores CC10, CC50 y CC90 se indican

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Reimpresiones y permisos

García-Murria, M.J., Gadea-Salom, L., Moreno, S. et al. Identification of small molecules capable of enhancing viral membrane fusion. Virol J 20, 99 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02068-1

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Recibido: 07 febrero 2023

Aceptado: 09 mayo 2023

Publicado: 24 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02068-1

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